[发明专利]基于三维有序金掺杂纳米二氧化钛电极的DNA生物传感器及其制备和应用

权利要求书

1.一种基于三维有序金掺杂纳米二氧化钛电极的DNA生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括三维有序多孔结构的金掺杂纳米TiO₂修饰的ITO电极，其表面固定DNA探针，所述的DNA探针为5’端标记有二茂铁的DNA探针5’-Fc-GAA CAA AAG GAA GAA AATC-(SH)-3’ ，标记为5’-Fc-ssDNA。

2.一种权利要求1所述的DNA生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1）制备三维有序多孔结构的金掺杂纳米TiO₂修饰的ITO电极，标记为3DOM GTD/ITO修饰电极；

2）将DNA探针溶液滴于3DOM GTD/ITO修饰电极表面，所述的DNA探针为5’端二茂铁标记的DNA探针5’-Fc-GAA CAA AAG GAA GAA AATC-(SH)-3’，标记为5’-Fc-ssDNA；在4 ℃下晾干，制得所述的DNA生物传感器，标记为5’-Fc-ssDNA /3DOM GTD/ITO修饰电极。

3.根据权利要求2所述的DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的3DOM GTD/ITO修饰电极采用以下方法制备：

1）制备金掺杂纳米TiO₂溶胶；

2）将处理好的ITO在1%PS小球乙醇溶液放置，随着乙醇溶液的挥发，PS小球通过自组装到ITO电极表面，形成六方紧密堆积结构，然后将其放置烘箱中于95℃恒温固化，即得到PS小球模板；

3）将PS小球模板倾斜，移取金掺杂纳米TiO₂溶胶沿PS小球模板斜面滴下，直到浸润整片模板，室温晾5-10min；再次滴加所述的金掺杂纳米TiO₂溶胶，重复上述过程3次，晾干备用；

4）马弗炉中高温煅烧去除模板中的PS小球模板，以2℃/min的速度升温至500℃，并恒温2h，然后以2℃/min的速度降至室温，制得所述的3DOM GTD/ITO修饰电极。

4.一种基于权利要求1所述的DNA生物传感器检测乳腺癌基因的方法，包括下列步骤：

1）DNA探针在修饰电极上的固定

取40μL 1.0×10^-5mol/L 5’-Fc-ssDNA溶液滴于3DOM GTD/ITO修饰电极表面，在4 ℃下晾干，制得5’-Fc-ssDNA /3DOM GTD/ITO修饰电极；

2）杂交反应

将步骤1）所述的修饰电极置于包含乳腺癌基因片段ss1的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中进行杂交，所述的基因片段ss1 DNA序列为5’-GAT TTT CTT CCT TTT GTTC-3’，取出电极，用二次蒸馏水清洗，去除非特异性吸附的基因片段ss1，在4 ℃下晾干；

3）电化学检测

采用三电极系统以示差脉冲伏安方法检测DNA杂交信号的变化，分别以制备的5’-Fc-ssDNA /3DOM GTD/ITO修饰电极和杂交后的该电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极，在电解液为0.1mol/L磷酸盐缓冲液中进行示差脉冲伏安扫描，根据峰电流的变化值测定乳腺癌基因片段ss1的浓度。

5.根据权利要求4所述的检测乳腺癌基因的方法，其特征在于，步骤3）中测定乳腺癌基因片段ss1的浓度的方法包括以下步骤：

a、ss1标准溶液配制：配制一组含不同已知浓度ss1的磷酸盐缓冲溶液；

b、建立工作曲线：将制备的DNA探针的修饰电极分别浸入不同浓度ss1磷酸盐缓冲溶液中进行杂交反应，反应完成后将电极取出，用二次蒸馏水冲洗，除去未杂交的ss1，在4 ℃下晾干；将DNA探针电极及杂交后的该电极在磷酸盐缓冲溶液中进行DPV扫描，记录峰电流的变化；峰电流值I与标准溶液中ss1的浓度c成反比，绘制I-c标准曲线，或采用线性回归法得到I-c线性回归方程；

c、乳腺癌基因样品的检测：将待测样品配制成溶液，在磷酸盐缓冲溶液中按照与步骤b相同的方法进行杂交反应和示差脉冲伏安扫描，记录响应电流；若杂交后的电极上响应电流无明显变化，表明待测样品中不含乳腺癌基因片段ss1；若响应电流减小，则表明样品中含乳腺癌基因片段，根据I-c标准曲线，得到样品中ss1的浓度。