[发明专利]一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法

权利要求书

1.一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（V/V）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；

2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13，分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流动相体系，对F13进行选择性地分离和化合物制备。

2.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：反相色谱柱为极性共聚的带正电荷的混合模式柱（XCharge C18）；采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性分离和纯化。

3.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。

4.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相中酸可以是以下酸中的一种或二种以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理，所述酸水溶液中酸的体积浓度为0.1%-0.5%（V/V）。

5.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物为50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

6.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；其采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对F13（分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%），采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-酸水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物；

2）选取组分F13采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为带正电荷的混合模式色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；体积浓度0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7,8八个化合物；

通过反相色谱制备获得两类八个高纯度蟾蜍二烯内酯化合物；所述两类化合物分别为4个氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物：化合物1为异沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2为去乙酰华蟾毒它灵-3-庚二酰精氨酸酯，化合物3为沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物4为远华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯；4个非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯：化合物5为远华蟾毒精，化合物6为乙酰华蟾毒精，化合物7为华蟾毒它灵，化合物8为3-去氢蟾毒灵。