[发明专利]中华鲟dazl基因序列及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及到生物工程领域，特别涉及到一种中华鲟dazl基因序列及其用途。

背景技术

中华鲟(Acipenser sinensis)是一种古老的大型溯河产卵洄游性鱼类, 具有在淡水中繁殖，海水中生长、发育的生活习性。由于筑坝、航运、污染和过度捕捞等人类活动的影响，中华鲟资源量急剧下降，1988年被列为国家一级重点保护动物。长江水产研究所自上世纪80年代即开始从事中华鲟人工繁殖工作，2012年实现了规模化人工繁殖，但此种方法需要对其亲本长期养殖，需要投入大量的人力、物力和财力，而且还存在亲鱼死亡等多种风险，因此，有必要寻求其他办法对该物种进行多途径的保护。近年来随着生物技术的快速发展，生殖细胞移植被认为是一种周期短而且有效的方法，在多种鱼类中有成功应用的报道。该种方法的实施需要首先鉴定出中华鲟生殖细胞的标记基因，在此基础上再鉴定并分离生殖细胞用于生殖细胞移植。

    DAZ基因家族成员均为生殖细胞标记基因，包括3个成员：daz、dazl和boule，其编码的蛋白质都含有一个保守的RRM结构域和一个或多个DAZ结构域。dazl在已研究的所有物种的雌雄生殖细胞都有表达，并在生殖细胞的发育周期中持续表达。由爪蟾dazl mRNA缺失的卵母细胞发育产生的蝌蚪没有PGC，意味着Xdazl与生殖细胞的发育有关。另外，鼠的雌、雄性Dazl突变纯合体均不育，表现为这种突变体没有精原细胞或卵原细胞。因此，对中华鲟dazl基因研究，了解其在生殖细胞中的表达特征，并应用于生殖细胞的鉴定、追踪和分离，可为中华鲟生殖细胞移植和种质资源保存等方面的应用研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中华鲟dazl基因序列及其用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明所述的中华鲟dazl基因的全长cDNA序列为2362bp，开放阅读框为675 bp，编码224个氨基酸，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述基因编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明利用荧光定量PCR技术检测中华鲟dazl基因在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、精巢、卵巢、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑）的转录水平，结果表明：dazl基因只在精巢和卵巢中表达，且卵巢的表达量是精巢的两倍左右。

本发明利用原位杂交技术研究了中华鲟dazl基因在精巢和卵巢中表达特征，结果表明：该基因在精巢中的精原细胞和初级精母细胞中有表达，在次级精母细胞中的表达量有所增加，而在精子细胞中几乎不表达；在卵巢中，中华鲟dazl基因在卵原细胞和初级细胞中大量表达。

本发明制备了中华鲟dazl蛋白的特异性多克隆抗体。

本发明利用Western Blot技术检测中华鲟dazl蛋白在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠、精巢、卵巢、垂体、下丘脑、端脑、中脑、小脑和延脑）的表达特征，结果表明：dazl蛋白只在精巢和卵巢中表达。 

本发明利用免疫组化技术研究中华鲟dazl蛋白在精巢和卵巢中的表达特征，结果表明：在精巢中，dazl蛋白在精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中有表达，而在精子细胞和精子中几乎不见；卵巢中，dazl蛋白在卵原细胞和初级卵母细胞中大量表达。

本发明的积极效果为：本发明提供了中华鲟dazl基因的序列和不同组织中的其RNA和蛋白表达特征，鉴定了一种中华鲟生殖细胞标记基因。该基因可以应用于筛选和分离中华鲟生殖细胞，为中华鲟生殖细胞移植和种质资源保存等方面的应用研究奠定基础。

附图说明

图1为Real-time PCR检测dazl基因在中华鲟不同组织中的表达特征；

图2为dazl基因在中华鲟卵巢和精巢中的表达特征。A和B为卵巢，B为A中矩形区域的放大；C为精巢；og为卵原细胞，Ⅰ和Ⅱ为初级卵母细胞；SG为精原细胞，PSP为初级精母细胞，SSP为次级精母细胞，SPD为精子细胞；

图3为dazl蛋白在中华鲟不同组织中的表达特征；

图4为dazl蛋白在中华鲟卵巢和精巢中的表达特征。A、B和C为卵巢，D、E和F为精巢。A和D为中华鲟dazl蛋白抗体的免疫荧光定位，B和E为细胞核的荧光定位，C和F为两种荧光的共定位。

具体实施方式

下面结合附图1至4进一步说明本发明的具体实施方式。

1．总RNA的提取