[发明专利]一种重组菌株与制备碱性β-甘露聚糖酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地，涉及一种重组菌株以及利用该重组菌株制备碱性β-甘露聚糖酶的方法。

背景技术

β-甘露聚糖酶（β-mannanase，EC3.2.1.78）是一种半纤维素酶，可以水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖等植物多糖（参见Tipdon,R.S.et al.:Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,32:299-316,Academic Press,New York,1976.）。甘露聚糖是自然界中存在的一种较为丰富的半纤维素资源，数量仅次于纤维素。豆科植物种子、针叶树木材、绿色咖啡豆等都含有大量的甘露聚糖，一些植物胶，如田青胶、角豆胶、魔芋精粉等几乎完全是由半乳糖或葡萄糖与甘露糖组成的甘露聚糖。利用β-甘露聚糖酶对上述植物材料进行深加工和综合利用具有很大的应用潜力。国内外现主要用于造纸工业纸浆的漂白、油井的破胶、降解植物胶生产低聚糖用作双歧杆菌促生长因子，防病抗衰老的保健食品以及饲料工业中作为抗营养因子。

β-甘露聚糖酶按其最适pH值的不同有酸性、中性、碱性之分，其中碱性β-甘露聚糖酶的研究相对较晚，发现主要由嗜碱芽孢杆菌（alkaliphilic Bacillus）产生，某些地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）也产生碱性β-甘露聚糖酶，如杨文博等报道了一株地衣芽孢杆菌NK-27，其最适pH值为9.0。一般情况下枯草芽孢杆菌，放线菌等产生中性β-甘露聚糖酶，而霉菌产生酸性β-甘露聚糖酶。第一个碱性β-甘露聚糖酶由Akino等发现。马延和等于199l报道了嗜碱芽孢杆菌N16-5的三个胞外碱性β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质，并于2004年报道了其中一种嗜碱甘露聚糖酶的基因序列。Takeda等于2004年发现了芽孢杆菌属的一个菌株JAMB-602产碱性β-甘露聚糖酶，此酶属于GH家族5，最适pH为9。目前所发现的嗜碱甘露聚糖酶的最适pH值最高为10，由Takeda等于2004年报道。

碱性β-甘露聚糖酶不仅可以生产用作双歧杆菌促生长因子的低聚糖，而且在需碱性环境的纸浆漂白等工业方面具有广泛的应用前景。但到目前为止，碱性β-甘露聚糖酶的制备仍旧是限制其工业应用的瓶颈，前人的报道中无论是使用碱性β-甘露聚糖酶的原产菌株还是使用重组菌株生产，其产量都比较低，或者需要发酵较长的时间。如马延和报道了由嗜碱芽孢杆菌N16-5菌株经培养优化后，产量达到500U/ml（参见CN1266096A）。朱泰承等用毕赤酵母表达来自嗜碱芽孢杆菌N16-5基因，发酵120小时左右碱性β-甘露聚糖酶的酶含量达6000U/ml（参见CN102433267A）。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能够较高水平的表达碱性β-甘露聚糖酶的重组菌株以及利用该菌株制备碱性β-甘露聚糖酶的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种重组菌株，该重组菌株为含有编码碱性β-甘露聚糖酶的基因的重组大肠杆菌，且所述基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供了一种制备碱性β-甘露聚糖酶的方法，该方法包括将第一方面所述的重组菌株接种至液体发酵培养基中进行发酵，获得含有碱性β-甘露聚糖酶的发酵液。

通过上述技术方案，本发明的重组菌株能够高水平地表达碱性β-甘露聚糖酶，所需发酵的时间较短。采用本发明的方法制备碱性β-甘露聚糖酶，最终得到的发酵液中的酶含量可达6000U/ml。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是发酵液中酶含量和蛋白浓度随发酵时间的变化曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，“酶含量”用每ml发酵液中含有的酶活力单位（U）数来表示，单位为U/ml，且在37℃、pH值为9.0的条件下，每分钟降解甘露聚糖释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U；“溶氧量”用溶氧电极测得的结果表示，且定义发酵开始时的溶氧量为100%。