[发明专利]应用液体冷媒诱导家蚕减数分裂型孤雌生殖的方法

说明书

技术领域

  本发明涉及昆虫遗传发育技术领域，具体涉及一种提高家蚕人工诱导减数分裂型孤雌生殖的方法。

背景技术

目前，家蚕遗传育种主要采用常规的杂交育种等手段，杂交育种在我国蚕品种五次更新换代方面发挥了很大的作用。杂交育种的实质就是通过不断淘汰不良基因，并尽可能地将优良基因聚集到亲本纯系中。然而，在家蚕育种实践中，人们发现在育种材料基因组中，优良基因往往与一些隐性不良基因紧密连锁，导致育种过程中淘汰不良隐性基因的效率较低，一般需要经12～15世代的选择，才能建立遗传稳定的品系（品种）。另外，随着家蚕育种研究的深入和蚕丝业对蚕品种特性更高的要求，现行的杂交育种方法已难以取得突破性进展，主要表现在育成的家蚕品种性状雷同、育种周期长、耗资大等方面。因此，需要进行家蚕遗传育种新方法的探索，一方面可为家蚕遗传育种提供新的遗传资源，促进家蚕品种性状水平的提高；另一方面，若能研究出周期短，见效快的育种新方法，将改变家蚕育种耗资巨大、经费不足等的不利局面。目前关于家蚕孤雌生殖的相关研究已初步表明，孤雌生殖在家蚕遗传育种新方法的研究中具有一定的作用。

在正常情况下，家蚕一般通过有性生殖方式进行繁殖，但在特定的条件下，也可以发生孤雌生殖。家蚕孤雌生殖类型分为非减数分裂型和减数分裂型两种。其中，二倍体未受精卵经诱导处理后获得的后代如为雌性则为非减数分裂型孤雌生殖后代，如为雄性则为减数分裂型孤雌生殖后代。家蚕非减数分裂型孤雌生殖的诱导成功率（成功率）较高（最高诱导成功率与有性生殖相似，>95%）。而家蚕减数分裂型孤雌生殖的诱导成功率（孵化率）很低，在我国还未见有成功的报道。家蚕减数分裂型孤雌生殖是指蚕卵减数分裂过程中，完成同源染色体相互分离，细胞核分裂，形成单倍体核的第一次成熟分裂，而在第二次成熟分裂过程中，仅两个染色单体分离而细胞核不分裂从而恢复了细胞核的二倍性，或是卵内的单倍体核再融合而恢复了细胞核的二倍性，并发育成新个体的特殊生殖发育形式。目前对细胞核染色体倍性恢复的具体机制尚不清楚。前苏联科学家对家蚕孤雌生殖诱导方法开展了较系统的研究，并成功获得减数分裂型孤雌生殖的家蚕纯合雄体。如Strunnikov报道的文献称，以-11℃冷藏30min处理欧系家蚕品种PC-29的未受精卵，可以获得3%-5%的孵化幼虫，而以同样方法诱导欧系家蚕品种白茧1号进行减数分裂型孤雌生殖，其孵化率仅为0.08%，且孵化幼虫只有3%可以完成世代。日本学者也曾开展了相关的探索，但只获得非减数分裂型孤雌生殖后代，而未见减数分裂型孤雌生殖后代的报道。本发明人实验室也曾参照文献报道的工艺条件，以我国现行的家蚕品种为材料，虽曾多次尝试诱导家蚕减数分裂型孤雌生殖，但均未成功获得雄性后代个体。我们认为不能取得同样结果的原因可能是，一为实验采用的家蚕品种不同（文献中所述的原苏联欧系蚕品种“PC-29”与“白茧1号”均无法得到）；二为文献中所说的工艺条件仅提及处理温度与时间，而未具体公开冷媒介质的种类，故在实验中我们只能先采用常规的空气为冷媒介质进行试验，但均未取得成功；而改用新颖的乙醇、甘油及氯化钠水溶液等液体冷媒介质后，均已取得成功。据此，我们认为不同的冷媒介质对家蚕减数分裂型孤雌生殖的诱导具有十分重要的意义。

发明内容

本发明目的是，针对我国家蚕传统育种中因新颖遗传资源匮乏，导致育成的家蚕品种性状雷同、育种周期长、耗资大等的缺陷，提供一种适合我国实用家蚕品种（中系蚕品种和中′日杂交种）开展家蚕减数分裂型孤雌生殖诱导，以获得完全纯合的遗传种质资源，聚集有利基因，提高家蚕品种性状，缩短育种周期的方法。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

    应用液体冷媒提高家蚕减数分裂型孤雌生殖诱导率的方法，该方法按以下步骤进行：

（1）未受精卵的收集和清洗：摘取中系蚕品种或中′日杂交种，羽化后在室温下保持8～12小时的处女蛾的腹部，经室温自来水冲洗后，在14目塑料网纱上搓揉，剥离出未受精蚕卵并去除组织杂质，再用室温自来水冲洗至干净，室温晾干后，备用； 

（2）液体冷媒的种类与预处理：将乙醇和甘油分别与水按v/v比配制成20～50%的乙醇水溶液和甘油水溶液，另将氯化钠与水按w/v比配制成20～50%的氯化钠水溶液，并将上述三种液体冷媒预冷至-11℃～-14℃；另准备大口径容器烧杯或塑料杯并预冷至-11℃～-14℃后，备用；