[发明专利]富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法。特别是一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列过程中从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及富集方法。

背景技术

玉米是全球第一大粮食作物，是全世界主要的粮食来源。我国玉米的总产量已超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成，这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3.2万个基因，这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。转座子标签法是分析基因功能的一种十分有效的方法，它的原理是利用一些在基因组中可移动、序列已知的DNA片段，即转座子的转座，插入到一个新的位点上，通过分离、测序分析它的侧翼序列，从而克隆研究这些基因的功能。目前在玉米中最主要的用于创建插入突变体的转座子是Mutator（Mu）和Activator/Dissociator（Ac/Ds）两个系统。在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中，分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。但目前用于分离Ac/Ds侧翼序列的方法还主要是利用通过Southern杂交或基于PCR技术的方法，其中基于GenomeWalking技术的PCR方法，即基于限制性内切酶酶切加接头的方法，相对于基于Southern杂交的方法具有较高的效率，但其由于受到限制性内切酶酶切位点的特异性，使得实验的通量难以进一步提高。因此需要建立一种新的、通量大的标签分离的方法，随着高通量测序方法的快速发展，目前已有将二代测序技术用于分离Mu转座子侧翼序列和克隆基因的研究，相比传统的通过Southern杂交或基于PCR技术的分离Mu转座子侧翼序列的方法大大提高了效率和通量。在Ac/Ds转座子的侧翼序列的分离方法中，一个主要的限制应用二代测序技术分离Ac/Ds侧翼序列的因素是高效的从基因组中富集出Ac/Ds的侧翼序列。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种富集Ac/Ds侧翼序列用的特异性引物。

本发明的目的之二在于提供利用这些特异性引物从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列的方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列用特异性引物， 其特征在于该引物为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的碱基序列。

一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用上述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.       将玉米基因组DNA用超声波打断，打断的DNA片段主带在1.6kb~4.0kb之间；

b.      将步骤a所得DNA片段回收后用Taq酶进行加A，得到加A的DNA片段；

c.       将步骤b所得加A的DNA片段回收后连接接头，所述的接头由接头1和接头2退火获得；所述的接头1的序列为SEQ ID NO：7所示的碱基序列；所述的接头2的序列为SEQ ID NO：8所示的碱基序列；

d.      将步骤c所得的DNA片段回收后，用Ac末端特异性引物和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；所述的特异性引物为SEQ ID NO：1所示的序列；所述的接头引物AP1为SEQ ID NO：4所示的序列；

e.       将步骤d所得的PCR扩增产物回收后，进行第二轮PCR扩增，所用的特异性引物为SEQ ID NO：2所示的序列和SEQ ID NO：5所示的接头引物AP2LTm；

f.       将步骤f所得的PCR扩增产物回收后，进行第三轮PCR扩增，所用的特异性引物Ac22为SEQ ID NO：3所示的序列和SEQ ID NO：6所示的接头引物AP2；

g.      将步骤f所得的PCR扩增产物回收，即为富集了Ac/Ds侧翼序列的样品。

上述的步骤e中的 PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，55°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。