[发明专利]一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测引物和探针、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID NO:4的序列，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团；所述引物的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。

2.权利要求1的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测的引物和探针，其特征在于，所述探针序列5’端标记FAM基团，3’端标记DABCYL非荧光淬灭基团。

3.一种单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2的任一所述引物和探针。

4.权利要求3的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括如下成分，样本提纯试剂，PCR扩增试剂和参考品试剂。

5.权利要求4的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述样本提纯试剂为裂解液、洗涤液和重复洗涤液；所述裂解液成分为二氧化硅、Triton X-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述洗涤液为Triton X-100、EDTA·2Na、异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为Triton X-100、EDTA·2Na；所述参考品试剂为HSVⅡ阴性对照、HSVⅡ阳性对照，HSVⅡ强阳性对照和HSVⅡ定量标准品；优选的，优选的，所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰Triton X-100、10mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na；所述HSVⅡPCR反应管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA·2Na、25微升石蜡油；HSVⅡ反应缓冲液为10pM HSVⅡ引物，5pM HSVⅡ探针、20mMPH9.050mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1mM EDTA·2Na、0.2mM dNtps。

6.一种应用权利要求1-2任一引物和探针或权利要求3-5任一所述的试剂盒进行单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，

样品制备；制备得到纯化的核酸；

PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-2任一引物和探针或权利要求3-5任一所述的试剂盒；

结果判定。

7.权利要求6的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法，其特征在于，所述样品制备为取0.5mL离心管做好标记，分别加入裂解液100μL然后加入待测样本50μL，混悬，室温静置10分钟进行裂解；10000g离心25秒，去上清；加入150μL洗涤液对进行洗涤，去除剩余蛋白、脂类、糖类等PCR反应抑制物，混悬，10000g离心25秒，去上清；加入150μL重复洗涤液，混悬，10000g离心25秒，去上清备用，纯化得到的沉淀即为核酸；所述裂解液为10mMPH7.01重量‰二氧化硅、1体积‰Triton X-100、10mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na、2M异硫氰酸胍；所述重复洗涤液为10mMPH7.01体积‰Triton X-100、1mM EDTA·2Na。PCR扩增和荧光值读取，采用权利要求1-3任一引物和探针或权利要求4的试剂盒；

结果判定。

8.权利要求7的单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为，38℃5分钟，95℃10分钟；进入以下循环：95℃15秒，58℃50秒，共40循环；所述荧光值读取为在PCR扩增每个循环的58℃，30秒时。

9.权利要求6-8任一所述单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测方法，其特征在于，所述结果判定为：

如果检测样本Ct值＜36，判断为阳性；

如果检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性；

如果检测样本Ct值≥36且Ct值≠0或40，样本重检；如果重检结果样本Ct值≠0或40，判断为阳性；如果重检检测样本Ct值=40或Ct值=0，判断为阴性。