[发明专利]利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞分选领域，具体涉及利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法。

背景技术

淋巴组织诱导细胞（lymph tissue inducer cell，LTi）是先天性淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILc）的一个亚群，能抑制对自身或外源抗原有害的免疫反应，分泌多种消除炎症的细胞因子，在多种炎症性疾病和自身免疫性疾病中扮演了重要角色。LTi细胞主要分布于人和动物的淋巴结中，如肠系淋巴结中，脾脏内也有存在，其它器官和外周血中也有存在，但数量有限。

RORγt（Retinoid related orphan receptor gamma t）是LTi细胞主要表达的转录因子，是LTi细胞的重要标志之一，但是RORγt定为于细胞内。并且Th17、ILc22等细胞也表达RORγt。因此，现有技术中进行LTi细胞的流式细胞分选时，通常会选取CD3、CD56、CD117、CD127等多色表面标记，抗体荧光过多，不仅使得细胞标记复杂化，实验过程太长，也影响了最终分选LTi细胞的纯度。因此，需要一种简单分选LTi细胞的方法，使其获得的TLi的纯度更高，也便于后续研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法，解决现有技术分选LTi细胞纯度相对较低的技术问题。

为实现上述发明目的，技术方案为：

利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法，具体步骤如下：

A.制备淋巴细胞悬液或外周血单个核细胞；

B.将步骤A所得淋巴细胞悬液或外周血单个核细胞加入同种荧光标记的CD3、CD19、CD11c、Gr-1和NKp46抗体，孵育，PBS洗涤，得洗涤细胞；

C.将步骤B所得洗涤细胞固定、清洗、离心，然后进行打孔，经染色后加入另一种荧光标记的RORγt抗体，避光反应后清洗细胞，离心，得RORγt抗体标记的细胞；

D.将步骤C所得RORγt抗体标记的细胞重悬后，上流式细胞仪进行分选CD3、CD19、CD11c、Gr-1CD4、NKp46阴性，RORγt阳性的细胞，得LTi细胞。

优选的，所述步骤A中，淋巴细胞悬液按如下方法制备，分离淋巴结、扁桃体、脾脏或肝脏组织，用PBS清洗后切割成组织块，放入37℃、不含钙和镁离子、含5mM EDTA的Hanks液中洗涤25分钟，然后离心除去表皮细胞，再加入胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶在37℃下消化30分钟后用PBS清洗，然后用细胞筛过滤，离心，得到淋巴细胞悬液。

更优选的，加入胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶的量为加入后溶液中胶原酶III、DNA酶I和中性蛋白酶的终浓度分别为1.0mg/mL、0.02mg/mL、0.1mg/mL。

优选的，所述步骤A中，外周血单个核细胞按如下方法制备，收集浓缩的白细胞，经人淋巴细胞分离液分离，得到外周血单个核细胞。

优选的，所述步骤B中，所述孵育是在温度为10-28℃条件下孵育15分钟。

更优选的，所述步骤C是将步骤B所得洗涤细胞加入淋巴细胞固定液中固定45分钟；再用洗涤液清洗、离心；然后用淋巴细胞打孔液重悬细胞，避光孵育30分钟，加洗涤液，离心，收集沉淀；加入染色液重悬细胞后用荧光标记的RORγt抗体，在10-28℃条件下避光反应30分钟，加入洗涤液清洗细胞，离心，得RORγt抗体标记的细胞。

本发明的有益效果在于：本发明公开了利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法，其方法简单，通过双色流式分选，即用同种荧光标记CD3、CD19、CD11c、Gr-1和NKp46抗体孵育后，将细胞穿孔，再用另一种荧光标记的RORγt抗体结合，最后筛选CD3、CD19、CD11c、Gr-1、NKp46双阴性，RORγt阳性的细胞即为LTi细胞，利用此方法获得的细胞纯度高，其纯度大于95.0%。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为利用RORγt为标记物分选细胞的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

利用RORγt为标记物分选LTi细胞的方法，包括如下步骤：