[发明专利]一种靶向性抗肿瘤融合蛋白及其编码基因与表达质粒

权利要求书

1.一种靶向性抗肿瘤融合蛋白，其特征在于，所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，该表达载体为含有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的重组载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体pET28a。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，该表达载体的构建方法如下：

A、基因突变体mAnxA5的构建

第一步：进行点突变，将AnnexinA5基因第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列

将缬氨酸突变为精氨酸采用重叠区基因扩增法，共需合成四条引物，分别为：

P1:5’GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ ID NO:5)

P2:5’GTCCCCACGCACCACGTCATCTTC3’(SEQ ID NO:6)

P3:5’GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTAC3’(SEQ ID NO:7)

P4:5’TTACAGTAGAAGAGGTGTCGACGC3’(SEQ ID NO:8)

其中：

P1与AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位点CCATGG；

P2含有精氨酸密码子的互补核苷酸序列ACG；

以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P1,P2为引物扩增，得到的序列称为P1P2；

P3含有精氨酸密码子序列CGT；

P4同AnnexinA5的3’末端互补，以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P3,P4为引物扩增，得到的序列称为P3P4；

引物P2,P3具有一段互补的序列，所以P1P2和P3P4的序列中也存在这一互补序列，将P1P2和P3P4变性后退火，可以在这段互补区形成双链；提供PCR反应条件，P1P2和P3P4可以互为引物进行扩增，扩增后的产物为P1P4；通过这种方法，将AnnexinA5第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列；

第二步：PCR扩增P1P4序列中的第一、二结构域，得到突变体基因mAnxA5

以P1P4为模板，以P1,P5为引物进行PCR扩增，得到的产物即突变体基因mAnxA5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

P1:5’GCCCATGGATGGCACAGGTTCTCAG3’(SEQ ID NO:5)

P5:5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA3’(SEQ ID NO:9)

P1与第一步所用的P1相同，P5与编码AnnexinA5第154-157位氨基酸残基的核苷酸序列互补；

将PCR产物P1P5克隆入质粒Puc19进行测序,证明所获得的序列与SEQ ID NO:1完全相同；

B、融合基因mAnxA5-MLT的构建方法采用重叠区延伸法连接，MLT的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

C、表达质粒pET28a-mAnxA5-MLT的构建

利用基因工程手段将融合基因mAnxA5-MLT用EcoR I、Sal I双酶切，然后与EcoR I、Sal I双酶切的载体pET-28a（+）连接，酶切结果证实，插入片段在500和750bp之间有一条带，与预期大小相符，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.一种如权利要求1所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.一种如权利要求2所述的编码基因在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种如权利要求3、4、5或6所述的表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

10.一种如权利要求7所述的靶向性抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。