[发明专利]动物肺组织的取材和固定方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物组织的处理方法，具体涉及实验动物肺组织的取材和固定方法，以及所述方法的用途。

背景技术

在肺损伤、肺脏疾病和药物非临床安全性评价肺组织学结构及正常肺组织结构等研究中，常需要进行组织学制片，并借助H.E染色或组织化学、免疫组织化学、原位杂交等各种特殊染色，进行光学显微镜观察与研究。由于肺组织主要由肺内支气管的各级分支及其终端的大量肺泡组成，呈现含有大量气体的海绵状结构等特殊性。如果和大多数脏器一样采用取出后浸泡固定法固定，将会因为肺泡内外压差的丧失以及制片过程中对肺组织的人为挤压，导致光镜下观察到的肺组织呈现大片肺萎陷图像，给观察肺泡隔的细微结构以及深入研究肺组织内各种细胞的功能等研究带来极大障碍。

为解决以上问题，目前OECD推荐采用心脏灌流固定法和气管灌注固定法（OECD Guidance Document on Histopathology for Inhalation Studies,28September2009Draft1-36）。这两种方法虽然部分解决了肺泡萎陷难题，但心脏灌流固定法使肺内血管尤其是肺泡壁毛细血管过度扩张，灌流后血管呈非生理状态，原有的病变（如血细胞边集、扣押等）遭到破坏，如灌流压力过大还会造成肺毛细血管破裂；气管灌注固定法从气管内灌注固定液，不可避免地将对肺泡壁产生过度挤压，使肺泡丧失生理状态下的组织结构特征。此外因肺组织病变存留在肺泡内的物质，如炎性渗出物、蛋白水肿液等都将被固定液冲走或改变其分布。以上方法的缺陷均给肺组织的病理诊断与研究带来了偏差甚至困难。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人通过大量实验和反复摸索，最终发现了一种操作简便、同时能使肺脏处于自然扩张状态的肺组织取材与固定方法，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及动物肺组织的取材和固定方法，其包括以下步骤：

（1）结扎已死亡动物的气管，在结扎处远心端离断气管，将整个肺脏和结扎的气管一起取出；

（2）将步骤（1）获得的整个肺脏进行固定，得到固定的肺组织；优选地，所述固定方法为将整个肺脏完全浸泡于固定液中。

根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中所述动物为哺乳动物，例如为小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、兔、羊、马、猪等。

在本发明中，所述动物的处死方法优选为能够使肺脏保持自然扩张状态的方法，例如不会暴露胸腔，或者不会因为过度挣扎导致血液进入肺组织（例如肺泡）。在本发明的实施方案中，所述处死方法为麻醉后腹主动脉放血处死。

根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中步骤（1）在结扎气管前，动物胸腔的负压状态未被破坏。

在本发明中，所述胸腔的负压状态未被破坏是指未暴露或伤及胸腔，或者虽然暴露或伤及胸腔，但由呼吸机维持胸腔的负压状态。

根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中所述将步骤（1）获得的整个肺脏完全浸泡于固定液中的方法可以为本领域公知的任何可实现的方法，例如包括，在固定液液平面或肺组织表面覆盖可以阻止肺组织浮出的物体、将重物与气管连接或者为了避免对肺组织的破坏，可以选择将肺组织与其它邻近组织（例如心脏等）一并取出，小动物可以其邻近组织的重量使肺组织完全浸泡于固定液中，大动物也可将重物与心脏连接。

在本发明中，所述重物是指该物体的重量足以使肺组织完全浸泡于固定液中，而且该重物不会被固定液腐蚀，不会影响肺组织的固定，不会破坏肺组织原有的生理或病理状态。

在本发明的实施方案中，所述重物与气管连接。

根据本发明第一方面任一项的取材或固定方法，其中所述固定液为本领域公知的组织固定液，例如为醛类溶液或醇类溶液，例如选自甲醛溶液、多聚甲醛溶液、乙醇溶液或者上述溶液的混合溶液，优选地，所述甲醛溶液或多聚甲醛溶液的浓度约为4%。

在本发明的实施方案中，所述固定液为4%中性甲醛溶液。

在本发明中，所述固定肺组织的方法为本领域所公知，例如可采用化学方法，如采用各种化学溶液做固定液。在本发明的实施方案中，所述固定肺组织的方法为采用固定液的方法。

在本发明中，所述固定肺组织的时间为本领域所公知，例如可根据选择的固定液不同确定相应的固定时间；在本发明的实施方案中，固定肺组织的时间为24小时。

在本发明中，所述肺组织为健康肺组织或处于病理状态的肺组织。

本发明第二方面涉及按照本发明第一方面任一项的方法制备得到的动物肺组织。