[发明专利]一种太平洋牡蛎胚胎超低温冷冻保存方法

权利要求书

1.一种太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，加入抗冻保护剂，预冷后装入麦管中进行分步降温，-40℃前采用两步慢速降温，-40℃后采用快速降温至-180℃后直接投入液氮中保存，28℃水浴解冻复温培育，检测运动率。

2.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎胚胎为担轮幼虫期胚胎，受精后于19±1℃温度条件下培养12-14h后发育至担轮幼虫期。

3.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎担轮幼虫期胚胎，经200目筛绢过滤浓缩。

4.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻保护剂为10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积），太平洋牡蛎胚胎中添加有0.2M的海藻糖。

5.按照权利要求1或4所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋牡蛎担轮幼虫加入海藻糖和抗冻保护剂后充分混匀，在0～4℃冰箱中预冷30分钟。

6.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述混合有0.2M海藻糖和10%DMSO（V/V，DMSO体积/太平洋牡蛎胚胎体积）太平洋牡蛎胚胎预冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麦管中，用封口粉封口后放入程序降温仪进行程序降温。

7.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述两步慢速降温是指0～-15℃降温速率为-1℃/分钟，-15～-40℃降温速率为-3℃/分钟，并且在-15℃停留3分钟。

8.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述快速降温是指-40～-180℃降温速率为-20℃/分钟，降至-180℃后直接投入液氮中长期保存。

9.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述保存后的太平洋牡蛎担轮幼虫解冻时取出装有担轮幼虫的麦管，放入28℃水浴解冻至麦管呈透明状态取出，室温放至完全融化，剪开麦管两端放入海水中培育，获取复活胚胎。

10.按照权利要求1所述太平洋牡蛎胚胎冷冻保存方法，其特征在于：所述培育胚胎的海水，是将海水消毒后，按海水体积计加有5%BSA。