[发明专利]一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法

说明书

技术领域

本发明涉及黄酮检测领域，更具体地，涉及一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法。

背景技术

水辣蓼为蓼科植物水辣蓼( Polygonum hydropiper Linn.)的全草，别名柳草、蓼子草、斑蕉草、蝙蝠草等。全草均可入药，水辣蓼味辛，温；具有祛风利湿，散淤止痛，解毒消肿，杀虫止痒等功效；主要用于痢疾、肠胃炎、腹泻、风湿关节痛、跌打肿痛、功能性子宫出血；外用治毒蛇咬伤、皮肤湿疹等症状。

黄酮的种类很多，其各自的功效也不尽相同，因此了解水辣蓼中不同黄酮类有效成分的含量能精确定位到不同的黄酮种类与疗效之间的关系，有助于了解其与药效学之间的联系。黄酮类化合物的分析方法一般分为分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、薄层扫描法等。分光光度法的原理是利用黄酮类化合物结构上的还原性基团与金属盐试剂形成有色配合物，在特定的波长处测定配合物的吸光度，从而计算其浓度与含量。其优点是设备简单，操作简便，但样品未经分离纯化，受色素和酚性成分的干扰较大，结果往往高于实际含量。毛细管电泳法具有快速、高效、经济、微量、多模式等优点；同时由于进样量少，因而制备能力差，且毛细管直径小，使光路太短，用一些检测方法（如紫外吸收光谱法）时，灵敏度较低，电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性。在黄酮类化合物的分离中，主要采用的方法是毛细管区域电泳(CZE)。薄层扫描法（TLCS）又称原位定量波层色谱扫描法（QTLC）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。样品经薄层层析分离后，直接在薄层扫描仪上，在选定波长处扫描，得到薄层斑点的面积积分值，由回归方程计算含量。该法不受其他成分干扰，方法简便、准确。缺点是不够灵敏，对生物高分子的分离效果不甚理想。

高效液相色谱法(HPLC)在分析中，以C18柱与C8柱最为常用，柱内填充粒径以10um和5um用的最多。其固液色谱法的原理是根据固定相对被测组分的吸附力大小不同而进行分离，分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。由于黄酮类化合物常带有酚羟基，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从而导致拖尾现象，所以黄酮类化合物的 HPLC法中需要加入酸来调节pH值，以抑制解离减少拖尾现象。HPLC法相对干扰少，分离效能高，灵敏度高，重现性好，测定结果更为精确可靠，但仪器设备较贵，且无法检测中药总黄酮的含量。

发明内容

为了弥补现有技术检测水辣蓼中的黄酮的空白，本发明首先提供一种同时定量检测水辣蓼中六种黄酮类成分的高效液相色谱方法，选用Waters色谱柱，选定甲醇和0.4%甲酸水溶液为流动相，进行梯度洗脱，流动相的流速为1ml/min，分为3个梯度洗脱，3个梯度的甲醇和0.4%甲酸水溶液的体积比例分别为45：55，55:45，70:30，将洗脱物分别在359nm处进行紫外检测，确定各组分的浓度。

所述的六种黄酮类成分为芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、异鼠李素和山奈酚。

所述的梯度洗脱的程序包括以下5个洗脱过程。

所述的Waters色谱柱为Waters Symmetryshield RP18 5.0μm 4.6mm x 250mm Column。

所述的芦丁在10.5~11.5Min处洗脱获得，金丝桃苷在11.8~12.8Min处洗脱获得，槲皮苷在16.5~17.5Min处洗脱获得，槲皮素在30.5~31.5Min处洗脱获得，异鼠李素在38.5~39.5Min处洗脱获得，山奈酚在40.0~41.0Min处洗脱获得。    本发明的优点在于，建立了一种同时检测水辣蓼中的六种黄酮的方法，填补了现有技术的空白，提高了水辣蓼的检测效率，为水辣蓼的产品质量控制提供了更好的解决方法。

附图说明

图1为10ug/ml混合对照品溶液的色谱图。

图2为芦丁等六种对照品的峰面积标准曲线图。

图3为芦丁等六种对照品的峰高标准曲线图。

图4为7种辣蓼样品中六种黄酮含量测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1  方法的有效性测试