[发明专利]载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物医药领域，具体涉及一种载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法。

背景技术

载脂蛋白AⅠ（ApoAⅠ）是人血清中高密度脂蛋白（HDL）的主要结构蛋白，约占HDL质量的32.5-35.0% ,因此，ApoAⅠ含量可以代表HDL水平，并与HDL中的胆固醇呈明显正相关。临床上ApoAⅠ测定常作为心脑血管病的风险度估计和ApoAⅠ缺乏症（如Tangier病：是一种罕见的遗传性疾病）的诊断。所有ApoAI的免疫测定技术均需用ApoAⅠ抗血清，目前国际和国内通用的ApoAⅠ测定试剂盒均采用免疫透射比浊法(Immunoturbidimetric assay,ITA)，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度ApoAⅠ抗血清显得非常重要。

传统技术制备载脂蛋白A1抗血清，是直接用人血清通过二次超速离心制备获得HDL，然后使用Sephsrose 4B柱层析，收集主峰为HDL组份，再用醇和醚作为溶剂，醇和醚的体积比例为2：3，在-20℃下连续搅拌12-16小时进行在脱脂，经过滤，将滤纸上的去脂HDL(ApoHDL)烘干，然后将其溶解经Sephadex G-150柱层析, 收集主峰Ⅱ为ApoA1组份,再经DEAE纤维素离子交换层析得纯品。再把制得的ApoA1免疫动物，以每次3mg/每只免疫动物的剂量进行免疫，免疫4-5次，甚至更多，制备获得ApoA1的抗血清。

传统方法直接从血浆中超速离心获得HDL需要的离心次数多，且耗时长，而且用有机溶剂对HDL进行脱脂的工艺要求严格，步骤控制难，如脱脂不完全，会影响ApoAⅠ的产率，甚至完全失败，而且在进行动物的免疫过程时，耗费的时间过长，制备时间缓慢，而且免疫动物时，免疫次数多、免疫的效价和成功率也极低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，该制备方法的优点有：

1).用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的HDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省，为大批量提取ApoAⅠ提供了条件；

2)用盐酸胍处理代替传统的有机溶剂低温脱脂步骤，方法简便，省时、透析后用凝胶柱层析，收集主峰为高纯度的ApoAⅠ且得率提高；

3)合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的三分之一，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。

为实现上述目的，本发明的载脂蛋白AⅠ抗血清的制备方法，包括如下步骤：

1) 高密度脂蛋白的提取：将用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-6mol/L的二价金属离子处理后提纯获得高密度脂蛋白；

2) 载脂蛋白AⅠ的提取：将获得的高密度脂蛋白通过浓度为4-10mol/L盐酸胍处理后经过超速离心、梯度层析，获得载脂蛋白AⅠ；

3) 载脂蛋白AⅠ抗血清的制备：将载脂蛋白AⅠ作为抗原，对免疫动物进行免疫反应，制备载脂蛋白AⅠ抗血清。

通过采用上述方案，将血清先通过低浓度的多阴离子化合物和二价金属离子处理后能够使血清中的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白沉淀，然后再加大二者浓度沉淀高密度脂蛋白，能够减少传统工艺当中的离心所花的时间和材料，使ApoAⅠ抗血清制备的效率大大提升，为大批量提取ApoAⅠ提供了条件；然后通过超速离心（密度范围用d =1.075-1.190），目的是去掉低端富含ApoC和高端富含ApoE的HDL颗粒，有利于后继的载脂蛋白A1的提纯，同时将HDL用盐酸胍处理，相比传统的醇醚脱脂(在低温下连续拌)，无机试剂的反应条件更加容易控制，而且工艺要求简单，避免了HDL脱脂时出现问题而影响ApoAⅠ的产率的情况发生，方法简便，省时、透析后用凝胶柱层析，收集主峰为高纯度的ApoAⅠ且得率提高；最后通过用将ApoAⅠ作为抗原注射到免疫动物身上，通过免疫动物本身的免疫反应产生ApoAⅠ抗血清，通过合理的加大剂量，可缩短抗血清的制备时间，而且免疫的成功率亦比传统方法提高。

本发明的进一步设置为，所述第1)步骤中，所述用于制备载脂蛋白AⅠ的血清通过多阴离子化合物和二价金属离子处理后，需再经过浓度为0.3-1mol/L的草酸钾获得高密度脂蛋白粗品。 

通过采用上述方案，将通过多阴离子化合物和二价金属离子处理后的血清用0.3-1mol/L的草酸钾进行处理，能够除去其中多余的多阴离子和二价金属离子，确保二者不会对后续的制备产生影响。