[发明专利]柑橘溃疡病感病基因CsLOB

说明书

技术领域

本发明涉及基因，尤其涉及一种柑橘溃疡病感病基因CsLOB。

背景技术

柑橘溃疡病在中国柑橘种植区普遍发生，以广东、广西、湖南和福建等地发生较重。发生严重时引起落叶、落果，植株生长不良，影响产量和品质。

柑橘溃疡病菌能够侵染寄主植物柑橘，在侵染点附近引起症状，其机制是柑橘某些基因不正常地过量表达，从而使得柑橘溃疡病菌成功地从植株获得了所需的营养物质。在柑橘溃疡病菌与寄主植物的识别过程中，柑橘溃疡病菌通过III型分泌系统分泌多种III型效应蛋白到植物细胞中，其中PthA被认为是引起柑橘产生柑橘溃疡病的主要毒性因子。PthA属于TALE(Transcriptional Activator Like Effector)类蛋白，其结构上在氮端和碳端是保守的，碳端存在核定位信号和转录激活域，在中间存在重复区域，每个重复由34个氨基酸组成，每个重复的12，13位氨基酸决定了蛋白与DNA的结合特性。PthA蛋白在被分泌到柑橘细胞中以后，首先会被定位到细胞核，然后按照其重复区域的识别密码找到相应的柑橘基因组DNA序列进行结合。其所结合的区域是感病基因的启动子区域。随后，通过PthA蛋白碳端的转录激活功能，柑橘基因组被结合DNA序列下游的感病基因被激活，经过一系列的信号传递后，柑橘发生溃疡病症状。

植物中的感病基因是病害发生的关键基因，其在与病原细菌的效应蛋白直接接触后会过量表达，随后激活植物的整个感病通路，最终导致植物发生病害。在柑橘溃疡病中，先前的研究并没有找到任何感病基因。柑橘溃疡病感病基因的获得，一方面，非常充分地解析了柑橘溃疡病发生的致病机理，另一方面，更能让我们通过日前已经初步成熟的基因组定点编辑技术手段(如TALEN和CRISPR-Cas等)对感病进行修饰，敲除其上游与PthA毒性因子结合的DNA序列。因此，基于本发明，利用转基因手段，可以在较短时间内获得对柑橘溃疡病菌具有抗性的柑橘新品种。

发明内容

本发明的目的，在为根除柑橘溃疡病提供理论基础，为基于转基因的基因定向敲除技术提供一种柑橘溃疡病感病基因CsLOB作为靶点基因。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明涉及的是甜橙中的CsLOB基因，其启动子能够被柑橘溃疡病菌主效毒性蛋白PthA识别。该基因被激活后过量表达，可直接导致柑橘发生溃疡病。其在Citrus sinensis Annotation Project网站(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上的编号为Cs7g27640，其启动子及开放阅读框(ORF)序列如SEQ ID NO.1所示，序列总长度为1214bp。该序列前500bp部分为启动子，其序列如SEQ ID NO.2所示。启动子中能被PthA特定识别的序列如SEQ ID NO.3所示，序列长度为18_bp。所述的CsLOB基因产物CsLOB蛋白能够在柑橘溃疡病菌侵染时过量合成，导致柑橘发生溃疡病。

本发明的CsLOB基因及其启动子被PthA识别的片段由以下方法获得：

利用转录组分析技术，用含用PthA的柑橘溃疡病菌株注射接种柑橘叶片，一定时间后取适量柑橘叶片，提取柑橘总RNA分析获取表达上调的基因。总共得到了108个表达上调基因，在Citrus sinensis Annotation Project网站的柑橘基因组数据库里获得了这108个基因的启动子序列，然后利用Target Finder和Talgetter两个在线比对网站进行查询。通过输入PthA的重复区域序列和所有上调基因的启动子序列，若干个候选基因被获得，其中CsLOB基因得分远高于其他基因，因此其被推测为是最有可能被PthA激活的基因。将CsLOB基因上游500bp的序列构建到具有GUS报道基因的载体上，利用农杆菌瞬时表达方法，检测得到CsLOB基因启动子可以被PthA转录激活。选定CsLOB基因上游的另一端序列作为靶序列，设计人造TAL蛋白并在柑橘叶片中进行表达，可以使得柑橘产生溃疡病，上述两实验确认了CsLOB基因是可被PthA转录激活的感病基因。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明获得了柑橘中与柑橘溃疡病菌互作的感病基因并且得到了与水稻植物中能够被柑橘溃疡病菌PthA蛋白识别的DNA序列。该感病基因的获得，为运用分子遗传学方法改良柑橘品种提供了资源，具有极大的应用价值。