[发明专利]一种脂肪酶及其突变体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其突变体。 

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid等，1998）。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。 

酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一；同时，很多酶学性质较好的蛋白在实际应用条件下，使用效果并不好。塔宾曲霉脂肪酶具有较好的胃酸和胃蛋白的耐受性；但是对胰蛋白酶耐受性较差。由于动物肠道是消化和吸收脂肪的主要器官，肠道中pH接近中性同时含有大量的胰蛋白酶；因此，肠道的消化特点限制了塔宾曲霉作为饲用酶制剂作用效果。 

寻找和克隆合适饲用脂肪酶的途径有2个：一是筛选产新型酶的微生物；二是对酶进行适当的蛋白质工程改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究最常用和最简单的手段之一；但是，其缺点是工作量大，随机性强；因此往往很难筛选到理想菌株。而蛋白质工程是这些年新兴的、借用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得理想蛋白或酶方法。其优点是工作量相对较小和概率大；缺点是多数突变体蛋白酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得更好效果的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型脂肪酶及其突变体。本发明利用分子生物学手段从塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）中克隆得到一种新型脂肪酶，所述脂肪酶与已报道的黑曲霉（Aspergillus niger）的脂肪酶仅存在五个氨基酸位点的不同，但所述位点的不同导致两者的酶学性质发生很大变化。为了进一步提高所述脂肪酶的胰蛋白酶耐受性，本发明通过蛋白质改造技术，获得了该脂肪酶的突变体，所述突变体对胰蛋白酶的耐受性得到显著提升，因此更有利于其在饲料领域中的广泛应用。 

本发明一方面提供了一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。 

所述脂肪酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。 

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:2的脂肪酶基因的质粒。 

本发明还包括携带有上述质粒的里氏木霉（Trichoderma reesei）。 

为了进一步提高上述脂肪酶的胰蛋白酶耐受性，本发明对氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶进行突变，获得了三个脂肪酶突变体。 

本发明提供了第一个脂肪酶突变体，是将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的142位氨基酸由Lys变为Ile。 

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:6。 

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的脂肪酶突变体基因的质粒。 

本发明提供的第二个脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的154位氨基酸由Lys变为Cys。 

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。 

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:8的脂肪酶突变体基因的质粒。 

本发明提供的第三个脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的156位氨基酸由Lys变为Trp。 

上述脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:10。 

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:10脂肪酶突变体基因的质粒。 

将上述的质粒转入里氏木霉中，重组表达的脂肪酶突变体对胰蛋白酶具有很好的耐受性。