[发明专利]一种用生物技术生产中药材原料喜树碱的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，是一种将双关键酶基因通过发根农杆菌介导转化喜树，从而提高毛状根喜树碱产量的方法。

背景技术：

喜树碱是喜树中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱，已有多种喜树碱类药物如依立替康和拓扑替康获得美国FDA认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。

多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱产量低及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入喜树中，继而获得转基因的发根系，并进行大规模的培养是提高喜树碱产量的最佳途径之一。

喜树碱的生物合成来自于萜类吲哚生物碱。由莽草酸途径的色胺与由5-磷酸脱氧木酮糖途径生成的裂环马钱子苷，在异胡豆苷合成酶(STR)催化下形成吲哚生物碱的共同前体异胡豆苷，再经几步酶促反应后最终生成喜树碱和羟基喜树碱。大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，香叶醇-10-脱氢酶(GlOH)，色氨酸脱羧酶(TDC)及1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)等关键酶在喜树碱的生物合成中具有重要作用。

我们利用已克隆的长春花CrSTR和CrGlOH基因，构建植物双价表达载体，以发根农杆菌C58C1为介导，将异胡豆苷合成酶CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶CrGlOH基因同时导入喜树下胚轴组织并再生出毛状根。通过高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量，筛选出喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。

我公司采用基因工程手段，将喜树碱合成过程中的两个关键酶基因CrSTR和CrGlOH共转化喜树，打破了喜树碱生物合成途径的瓶颈效应，获得喜树碱高产的喜树毛状根或植株，为生产喜树碱和羟基喜树碱提供了新型优质药源。

发明内容：

本发明包括如下步骤：

(1)以CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列设计引物，以长春花幼苗RNA为模板PCR获得CrSTR和CrGlOH基因片段；将CrSTR和CrGlOH基因插入植物表达载体pCAMBIAl304质粒，构建重组载体；

(2)将获得的重组载体转入发根农杆菌C58C1，构建含有重组载体的发根农杆菌；

(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌转化喜树下胚轴，获得毛状根；

(4)检测毛状根中的异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；

(5)用高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量，进一步筛选喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。

具体实施方式：

下面结合具体实施例详细阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆建议的条件。

实施例1

长春花CrSTR及CrGlOH基因片段的获得

1.1长春花总RNA的提取及cDNA第一链的合成

使用TIANGEN公司提供的RNA提取试剂盒从长春花幼苗中提取总RNA(提取步骤参照试剂盒内的说明书)。用于提取总RNA的长春花幼苗的鲜重量为0.1g左右，提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度，分别以0.5ug RNA为起始量，用反转录酶进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。

1.2CrSTR和CrGlOH基因片段的获得

根据CrSTR和CrGlOH基因的编码序列，分别设计扩增出完整的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。

实施例2

含长春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表达载体的构建