[发明专利]一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒

说明书

 

【技术领域】

本发明涉及一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒,为一种检测动物源性食品中硝基咪唑的酶联免疫试剂盒。

 

【背景技术】

甲硝唑、二甲硝唑和洛硝哒唑是属于常用硝基咪唑类药物，用于预防和治疗特定病菌和原生动物疾病。由于硝基咪唑类化合物具有潜在的致癌性、诱导有机突变性，故欧盟和我国已禁止在任何动物源性食品中使用该类药物。目前测定硝基咪唑类的方法主要有气相色谱法和气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。但因这些检测方法投入成本高，检测时间长，方法复杂，现阶段不适宜在我国广泛推广使用。我公司研制出硝基咪唑类ELISA快速检测试剂盒，其方法简单，时间短，检测成本低，相比市面上的同类国产和进口产品，不仅价格低廉，质量还具有绝对优势，具有稳定性强，检测结果重复率高的特点。农业部发布的193号公告的《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》中,硝基咪唑在所有食品动物肌肉中禁止使用。因此,为确保动物源性食品的安全和对外出口贸易的发展,建立准确可靠,灵敏度高的定性定量方法是十分必要的。本发明由此产生。

 

【发明内容】

为解决现有技术的上述技术问题，本发明的目的是提供一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，样品前处理过程简单，检测时间短、费用低廉，灵敏度和检测限都大幅度提高且能同时检测大批样品。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种硝基咪唑类药物快速检测试剂盒，它含有：

(1)包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板；(2) 酶标记硝基咪唑特异性抗体或酶标记硝基咪唑抗原；(3)硝基咪唑标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液。

包被硝基咪唑抗原的酶联板或包被硝基咪唑特异性抗体的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将硝基咪唑半抗原与载体蛋白偶联物或抗抗体以0.02~0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15~30s，拍干；

 (3)向酶联板的每孔中加入150~200μl封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

所述缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%~15%吐温-20的去离子水或超纯水；所述的封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；该载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白、血蓝蛋白等大分子载体。

所述的硝基咪唑酶标记抗原为采用戊二醛法将标记酶与硝基咪唑半抗原进行偶联得到。

所述的硝基咪唑特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

所述单克隆抗体制备的步骤为：

（1）、动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(硝基咪唑半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80~100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；（2）、细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5~10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（3）、细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l~5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；（4）、单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05~106个/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；（5）、抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；（6）、抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08μg/ml浓度进行稀释。