[发明专利]一种地塞米松快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有：

(1)包被地塞米松抗原的酶联板或包被地塞米松特异性抗体的酶联板；(2) 酶标记地塞米松特异性抗体或酶标记地塞米松抗原；(3)地塞米松标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液和(7)浓缩复溶液。

2.如权利要求1所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于，所述包被地塞米松抗原的酶联板或包被地塞米松特异性抗体的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将地塞米松半抗原与载体蛋白偶联物或抗体以0.02-0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15-30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

3.如权利要求2所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L、含有0.5%甲醇的碳酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含有8%-15%吐温-20℃的去离子水或超纯水；所述的封闭液为含有8%-15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、人血纤维蛋白或血蓝蛋白。

4.如权利要求1所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标记地塞米松抗原为采用戊二醛法将标记酶与地塞米松半抗原进行偶联得到。

5.如权利要求1所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于，所述的地塞米松特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

6.如权利要求5所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体制备的步骤为：

（1）动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，地塞米松半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物免疫剂量为80-100μg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；

（2）细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5-10：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

（3）细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l-5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；

（4）单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×l05-106个/只，7-10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存；

（5）抗体冻干粉可将腹水在37℃环境下烘干，放入-20℃保存；

（6）抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08μg/ml浓度进行稀释。

7.如权利要求5所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于所述多克隆抗体制备的步骤为：

采用新西兰大白兔作为免疫动物，地塞米松半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物免疫剂量为1mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂；最后一次免疫7-l0天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

8.如权利要求1所述的地塞米松快速检测试剂盒，其特征在于：当标记酶为过氧化物酶时所述的底物显色液为过氧化氢或过氧化脲与四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，所述的终止液为0.1-0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，所述的底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，所述的终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液。