[发明专利]具有内部校准的测定

说明书

相关申请的交叉引用

本申请是2013年3月15日提交的美国申请号13/833,365的继续申请，该美国申请为了所有目的通过引用而全文并入本文。

技术领域

本文提供了用于具有内部校准的测定的试剂盒和方法。

背景技术

在过去几十年中，已经使用荧光、化学发光或响应于分析物产生信号的其他手段进行了测定。目前，许多测定通过测量在反应混合物的总体积中产生的光信号的强度来进行。产生的光信号可以通过光学手段来测量，其中产生的光信号由大量分子发出。在典型的实施方案中，这些测定可以如下进行：将怀疑含有抗原的样品与包含附接至固体支持物(例如，微粒)上的第一抗体的试剂组合，以形成反应混合物。该抗原如果存在于样品中，则与该第一抗体特异性结合。向反应混合物中引入包含其上附接有标记的第二抗体的偶联物，并与所述抗原特异性结合，该抗原与第一抗体特异性结合，该第一抗体如前所述附接至固体支持物上。这样的测定被称为夹心测定或免疫计量测定。这种类型的测定示意性地示于图1中。通常在通过进行洗涤步骤从反应混合物中除去未结合的偶联物之后，测量由标记物引起的信号。测量来源于反应混合物的总体积的信号，然后将其与校准曲线进行比较，以确定样品中存在的抗原的浓度。

当测定不包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物时，其被认为是‘一步’测定。当测定包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物时，其通常被认为是‘两步测定’(或延迟的一步测定，这取决于如何进行分离)。

在标准的夹心测定中，第一步是使用一组具有已知浓度的分析物校准物生成校准曲线。然后，使用该校准曲线确定未知样品的浓度。

发明内容

本发明提供了用于测定(如免疫测定)的内部校准的试剂盒和方法。本文所提供的内部校准方法和试剂盒无需制作校准曲线，并允许基于单一内部校准的参考点来确定大量测试样品中的分析物的存在和/或浓度。

因此，在一方面，本发明提供了试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含：包含第一标记物的示踪分析物、捕获分析物结合分子和包含第二标记物的检测分析物结合分子，其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子能够同时与该示踪分析物结合。在不同的实施方案中，该捕获分析物结合分子附接至固体支持物上。在一些实施方案中，该固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，该捕获分析物结合分子和/或该检测分析物结合分子之一或两者是抗体或其片段。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物之一或两者是发色团。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物之一或两者是荧光团。

在另一方面，本发明提供了对测定进行内部校准的方法。在一些实施方案中，该测定包括：

a)使捕获分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度的用第二标记物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子同时与该示踪分析物结合；

b)测量所获得的第一标记物的信号强度(I1₀)和第二标记物的信号强度(I2₀)；

c)将校正因子(F)确定为第二标记物的强度(I2₀)与第一标记物的强度(I1₀)的比值；由此该校正因子的确定用于对所述测定的内部校准。通常，该方法在不存在测试样品的情况下进行。

在另一方面，本发明提供了确定一个或多个测试样品中的分析物浓度的方法。在一些实施方案中，该方法包括：

a)在不存在或存在可能包含测试分析物的一个或多个测试样品的情况下，使捕获分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度的用第二标记物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子同时与该示踪分析物结合，并且如果存在的话，同时与所述一个或多个测试样品中的测试分析物结合；

b)测量在不存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度(I1₀)和第二标记物的信号强度(I2₀)；

c)将校正因子(F)确定为第二标记物的强度(I2₀)与第一标记物的强度(I1₀)的比值；

d)测量在存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度(I1)和第二标记物的信号强度(I2)；以及