[发明专利]脂质膜包封的具有膜蛋白的粒子

说明书

本发明涉及模型脂质双层和在其中支撑的膜蛋白。

膜蛋白在每个活细胞中发挥关键作用，这由生物的编码膜蛋白的大量基因体现。20-30％的生物基因编码膜蛋白。这些蛋白质是细胞代谢例如细胞-细胞相互作用、信号转导和离子及养分运输中的关键因素。因此，膜蛋白是约60％的全部药物的靶。然而，膜蛋白的机理性细节有时难以获得，尤其是当不可忽略膜/水界面的作用时。已经开发了生物模拟膜系统，从已经重构有膜蛋白的脂质体至平面状脂质双层或束缚的双层脂质膜。

与生物学中的这种基本职能相反，实验性技术仍难以接近膜蛋白。难以进行膜蛋白的结构及功能表征，原因在于它们的两性特性。实验挑战在于，一旦它们从天然脂质双层取出并在去垢剂的辅助下溶解，膜蛋白对变性敏感。为了模拟天然脂质环境，将溶解的膜蛋白再整合(重构)在人工脂质双层或脂质类似物中。

生物膜的各种模型系统解决了这个问题。将溶解的膜蛋白纯化并重构；即，再整合在模拟质膜中其天然环境的(人工)脂质双层中。在经典脂质体系统中，脂质双层包围一个内腔。因此当需要控制内区室的内容物或溶质浓度时，实验难题出现。对于施加限于通过使用离子特异性离子载体生成扩散电势的跨膜电位而言，同样如此。

已经应用几种在固相支持物上的重构策略，如向杂合脂质双层膜插入链烷硫醇和磷脂的自装配单层、束缚的脂质双层膜(Knoll等人,Reviews in Molecular Biotechnology 74(2000)137)、聚合物膜和Langmuir-Blodgett薄膜。

为了控制固定化膜蛋白的取向，Giess(Biophys.J.87,(2004),3213-3220)和Ataka等人(J.Am.Chem.Soc.2004,126,16199-16206)公开了借助His标签和Ni-次氮基三乙酸(NTA)部分在表面上固定膜蛋白并在脂质环境中通过原位透析进一步重构溶解的蛋白质。

公开WO 2008/118688 A2披露了一种稳定的、支撑的脂质双层膜，其中膜通过固定至表面上的固醇分子稳定化。在制造这种膜期间，第一固醇分子固定在表面上并且随后用膜溶液重构膜。膜溶液可以含有膜蛋白。这些膜模型存在以下问题：分子在膜中的活动性低和膜下缺少任何含水层，而这通常是天然膜蛋白活性和行为所必需的。

JP 2011/027632 A描述了具有脂质双分子膜的生物芯片，所述脂质双分子膜以基底上亲水性部分和疏水性部分的一种样式固定到基底上。

US 2008/0304068 A1涉及具有层状设置的蛋白质生物芯片，所述层状设置包含金属层和任选地在有源层上的脂质双层膜。如WO 2008/118688 A2所提到，这种设置不合适研究膜蛋白并且在以下问题：蛋白质的活动性低和缺少含水层。

WO 99/10522 A1涉及基于磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的不同人工膜及用于分析药物化合物结合行为的检验。其公开内容缺少整合至膜中的膜蛋白。

WO 9610178 A1涉及一种通过微团或小泡与膜融合将来自微团或小泡的膜蛋白插入平面状脂质膜的方法，其中融合由可以与微团或小泡共价结合的膜的官能团介导。

US 7,939,270涉及用膜蛋白(如孔蛋白或通道蛋白)探测固体表面上的平面状脂质膜，因而将该蛋白质插入膜中，并检测插入。US 6,440,736提供向细胞或细胞膜人工插入膜蛋白的又一个方法。

CA 1243946 A1描述一种抗原/脂质体缀合物，其中蛋白质抗原与脂质体小泡的脂质分子共价结合。WO 01/06007 A2提供一种用于研究和表征受体的微泡系统。脂质体小泡和微泡存在稳定性比固体表面结合的膜低的问题，特别地在操作膜蛋白期间。

WO 2009/117370 A1描述了膜包覆的粒子。该膜是包含膜蛋白的天然细胞膜，所述膜蛋白至少部分地处于如细胞中存在那样的天然取向。将膜包覆的粒子描述为适于高通量读出、尤其在配体结合测定中适于高通量读出的一批次相似或几乎相同的细胞膜显示器。但是使用细胞膜(在这种情况下CHO细胞的细胞膜)是耗时的，需要分离生物细胞膜，这可能在不同目的蛋白的测定中造成对膜组分的不利影响。另外，膜无法在粒子上稳定化，这可能造成进一步的分析不精确。

US 7,205,099 B2涉及一种在包覆到扁平固相支持物上的人工脂质双层中研究钾离子通道的方法。