[发明专利]在3位具有羧烷基取代的睾酮及其在制备用于测定生物学样品中的睾酮浓度的标记的类固醇中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及检测生物学样品中的睾酮的领域。具体地，本发明涉及特别可用于免疫测定的衍生自睾酮的新化合物，其制备方法，以及其在测定睾酮中的用途。

背景技术

通常称作睾酮的17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮是人中的主要雄激素。其由睾丸中的Leydig细胞在垂体激素：LH(黄体生成素)的影响下分泌。

睾酮大部分结合至转运蛋白循环，主要是SHBG(性激素结合球蛋白)和白蛋白。游离睾酮相当于总睾酮的1-2％(Litwack G.,1992)。

具有原子编号的睾酮的结构式如下所示。

在人中，睾酮在精子发生、外生殖器的成熟、第二性征(胡须、阴毛和腋毛)和蛋白合成代谢中发挥作用。因此，测定人中的睾酮使得可以评价睾丸类固醇合成功能。认为3.2ng/ml以上的血清睾酮水平为正常，低于2ng/ml的水平使得能诊断身体的性腺机能减退或女性化。人中正常值的上限为8-9ng/ml。

在女性中，睾酮由卵巢和肾上腺少量分泌。其主要产生自前体(特别是雄烯二酮)的外周转化。因此，测定女性中的睾酮使得能探索雄激素分泌。高水平的睾酮可能与多囊卵巢综合征、卵巢或肾上腺肿瘤、肾上腺增生或者特发性多毛症相关。

几种方法可用于定量生物学样品中的睾酮。这些方法可以分为2个主要的组：

(1)质谱(MS)

这种分析技术允许测定所分析的化合物的分子量以及鉴定和定量它们。应用于复杂混合物如生物流体，其需要结合允许降低复杂性的分离技术。最常用的是气相色谱(GC)或液相色谱(LC)。串联质谱(MS/MS)组合2个分析仪。第一分析仪中选择的离子化合物在第二分析仪中更细致地分析。这种双重分析使得可以显著增加方法的特异性。因此，可以通过组合分离技术和MS技术的几种方法测定睾酮：

-同位素稀释气相色谱-质谱(ID-GCMS)(Moneti G.,et al.,1987；Wudy,S.A.,et al.,1992)。

-同位素稀释液相色谱-串联质谱(ID-LC-MS/MS)(Thienpont L.,et al.,2008)。

(2)用标记的免疫测定

也称作免疫学测定或免疫化学测定的免疫测定方法包括待检测的分析物睾酮与至少一种第一化合物之间的免疫学反应，所述第一化合物是这种分析物的结合配对物。因为睾酮测定通过竞争进行，所述方法还包括另一化合物，其与待测定的睾酮竞争，并且是睾酮衍生物。因此将两种化合物之一标记用于可视化。这种标记的化合物称作标记的缀合物。

当然，术语“免疫”，例如在“免疫测定”中，在本申请中并不认为严格表示结合配对物是免疫学配对物如抗体。事实上，当也称作配体的结合配对物不是免疫学配对物，而是例如待测定的分析物的受体时，本领域技术人员也广泛使用这个术语。因此，术语ELISA(酶联免疫吸附测定)往往用于使用非免疫学结合配对物的测定，在英语中更一般称作“配体结合测定”，而术语“免疫”包括在首字母缩略词ELISA中。为了清晰，申请人在整个申请中对使用结合配对物的任何测定均会使用术语“免疫”，甚至当其不是免疫学配对物时也是如此。

根据使用的标记的缀合物的类型和这种缀合物可以产生的信号的类型，三种类型的免疫测定之间产生区别：

-放射性同位素免疫测定(RIA)(Cekan,S.Z.,1979)，其之前可以是分离技术如高效液相色谱(Ueschiba,H.et al.,1991)，

-免疫酶促测定或EIA“酶联免疫测定”。根据所选的酶底物，我们可以具有比色信号(ELISA)(Rassasie,M.J.,et al.,1992)、荧光信号(ELFA)或化学发光信号(CLIA)(Stabler T.V.,et al.,1991)。

-电化学发光免疫测定(Owen,W.E.,et al.,2010)。

因此最后两种类型的免疫测定称作非放射性同位素免疫测定。

20世纪60年代RIA方法的开发使类固醇的定量发生变革。那时使用的示踪剂为放射性睾酮衍生物(³H或¹²⁵I)如标记的睾酮-3-(O-羧甲基)肟(或睾酮-3-O-CMO)(Cook B.and Beastall G.H.,1987)。但是，这些方法具有显著缺点，放射性废物的处理和标记的试剂相对较短的半衰期。