[发明专利]PCR反应混合物及使用其的方法

权利要求书

1.一种反应混合物，其包括：

A.试样；

B.6个以上的引物集，其中至少多数所述引物集是不对称的；

C.6个以上的探针，其在4个以上的不同通道中发荧光，其中：

I.所述探针各自结合至选自(a)由一个或多个所述引物集扩增的靶标的PCR产物；和(b)对照多核苷酸的多核苷酸，于是使所述探针的荧光活化；

II.在至少一个所述通道中，多种不同的靶标-探针荧光特征为可辨的；

III.其中至少多数所述引物集的正向引物和反向引物为热启动引物。

2.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述热启动引物包含通过活化酶的作用而反转的失活化学修饰，其中当在升高温度下所述热启动引物杂交至互补序列时所述热启动引物成为所述活化酶的底物。

3.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于至少3个所述通道，在所述通道中发荧光的大部分或全部的所述探针的长度为19-26个核苷酸。

4.根据权利要求3所述的反应混合物，其中，对于其中在所述通道中发荧光的大部分或全部所述探针的长度为19-26个核苷酸的各通道，在所述通道中发荧光的至少一个探针为茎共享探针。

5.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于其中多种不同的靶标-探针荧光特征为可辨的各通道，在所述通道中发荧光的所述探针的大部分或全部为茎共享探针。

6.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于其中多种不同的靶标-探针荧光特征为可辨的各通道，所述不同的靶标-探针荧光特征是由于所述通道中的多个探针、与单个探针相互作用的多种已知的靶序列，或者它们的组合。

7.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，在其中多种不同的靶标-探针荧光特征为可辨的至少两个通道中，多个探针在所述通道中存在。

8.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，在其中多种不同的靶标-探针荧光特征为可辨的至少一个通道中，存在多种已知的结合单个探针的靶序列。

9.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于大部分所述探针，所述探针的茎的内部解链温度(T_M)比所述探针与期望检测的靶序列的杂合体的T_M高6-13℃；或者，如果期望检测多于一个靶序列，则所述探针的T_M比所述探针与各所述靶序列的杂合体的T_M高6-13℃。

10.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于其中探针也杂交至不期望在所述通道上检测的已知靶序列的各个情况，探针的内部T_M比所述探针与不期望在所述通道上检测的所述已知靶序列的T_M高至少17℃。

11.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于大部分或全部所述探针，所述探针与期望检测的靶序列的杂合体的解链温度(T_M)为58-72℃。

12.根据权利要求1所述的反应混合物，其中，对于大部分或全部所述探针，内部解链温度(T_M)为65-82℃。

13.根据权利要求12所述的反应混合物，其中，对于各探针，所述内部T_M为68-78℃。

14.根据权利要求1所述的反应混合物，其中各所述靶标选自病原体中发现的多核苷酸和内部对照多核苷酸。

15.根据权利要求14所述的反应混合物，其中所述病原体在各情况下选自细菌和真菌。

16.根据权利要求14所述的反应混合物，其中所述靶标的至少之一为抗生素抗性基因。

17.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述靶标包括至少一个病原体标记物多核苷酸和至少在所述病原体中的与抗生素抗性相关的多核苷酸。

18.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述靶标包括革兰氏阳性菌的至少一个标记物多核苷酸和至少在所述革兰氏阳性菌中的与抗生素抗性相关的多核苷酸。

19.根据权利要求1所述的反应混合物，其中所述靶标包括革兰氏阴性菌的至少一个标记物多核苷酸和至少在所述革兰氏阴性菌中的与抗生素抗性相关的多核苷酸。