[发明专利]条形编码核酸

说明书

本申请要求2012年11月5日提交的美国临时申请号61/722,357的优先权权益，该美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

序列表通过电子提交而随本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序列表被包含在被命名为“RUBCP0031WO_ST25.txt”的文件中，所述文件是2KB(如在Microsoft中所测量)并且在2013年11月5日创建。

技术领域

本发明大体上涉及分子生物学和核酸测序的领域。更具体地说，它涉及条形编码(barcoding)核酸的方法。

背景技术

条形码可以被用于鉴定核酸分子，例如其中测序可以揭示与所关注的核酸分子连接的特定条形码。在一些情况下，可以使用序列特异性事件来鉴定核酸分子，其中所述条形码的至少一部分在所述序列特异性事件中被识别出，例如所述条形码的至少一部分可以参与连接反应或延伸反应。所述条形码因此可以允许对与其连接的gDNA分子进行鉴定、选择或扩增。

一种使条形码与所关注的核酸分子结合的方法包括制备Ion gDNA片段文库，如由生命科技公司(Life Technologies)对于Ion Torrent系统所述。在这种方法中，使gDNA的片段与衔接子连接，其中使每一个基因组DNA片段的至少一端与包含条形码的衔接子连接。可以使用PCR用针对所述衔接子的引物对所连接的衔接子和gDNA片段进行切口修复、尺寸选择、以及扩增以产生扩增的文库。举例来说，可以使用包括16种不同的条形码的连接衔接子制备16种不同的gDNA样品，每一种gDNA样品具有独特的条形码，因此可以将每一种样品通过PCR使用相同的PCR引物单独地扩增，然后汇集(混合在一起)或者可以首先将每一种样品汇集，然后使用相同的PCR引物同时扩增。因此，每一种gDNA样品可以通过它所附接的独特的条形码来被鉴定。然而，所需的不同的连接衔接子的数目等于条形码的数目。举例来说，以混合物的形式产生能够被测序的256种样品文库将需要256种不同的连接衔接子。

发明内容

本发明的实施方案提供了制备用于测序的带双重条形码的核酸分子的方法。在核酸分子的同一端上具有第一条形码和第二条形码可以容许测序读取从第二条形码开始，继续经过第一条形码，然后进入到核酸分子中。因此可以在单次读取中获得对第二条形码、第一条形码以及所述核酸分子的序列进行的鉴定，而不是不得不使得从核酸分子的每一端进行测序读取以从核酸分子的远端向后对单个条形码的序列进行读取，正如在使用双重测序条形码的传统方法中的情况那样。

因而，本发明的一个实施方案涉及一种制备带双重条形码的核酸分子的方法，所述方法包括：使茎-环寡核苷酸的一条链与核酸分子结合以形成第一条形码结合的核酸分子，所述茎-环寡核苷酸包含分子内反向重复序列和环，所述反向重复序列包含第一条形码；通过链置换或通过切口平移聚合将所述茎-环寡核苷酸的一条链从所述第一条形码结合的核酸分子中置换，以形成带第一条形码的核酸分子；使引物与所述带第一条形码的核酸分子退火，所述引物包括与所述带第一条形码的核酸分子互补的第一部分和包含第二条形码的第二部分；以及使退火的引物延伸以形成带双重条形码的核酸分子，所述带双重条形码的核酸分子包含所述第二条形码、所述第一条形码、以及所述核酸分子的至少一部分。在一些方面，所述引物的第一部分与所述第一条形码或所述第一条形码的一部分退火。在其它方面，所述引物的第一部分不在所述第一条形码内退火。可以通过使用聚合酶，例如经由聚合酶链反应或PCR来进行延伸。所述核酸分子可以是基因组DNA、cDNA、扩增的DNA、核酸文库、或其片段。