[发明专利]在原生动物中重组制备鲎C因子蛋白的方法

说明书

本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。具体地，本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子蛋白的方法，该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。另外，本发明提供由所述新方法制备的重组C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。

技术领域

本发明提供一种重组制备来自鲎的C因子蛋白的新方法，所述方法使用表达所述C因子蛋白的寄生原生动物。相应地，本发明提供含有编码鲎C因子蛋白的多聚核苷酸的寄生原生动物宿主细胞以及制备C因子的方法，该方法包括在使得所述细胞表达所述鲎C因子蛋白的条件下培养所述寄生原生动物宿主细胞。本发明提供由所述新方法制备的重组鲎C因子蛋白和它在内毒素的检测和/或清除中的用途。

背景技术

内毒素(也已知为脂多糖(LPS))是革兰氏阴性细菌细胞膜的一种基本成分，并造成许多(如果不是全部)发生在革兰氏阴性细菌败血症期间的毒性作用。

来自革兰氏阴性细菌的LPS引起鲎的变形细胞聚集和成颗粒状。据推测，LPS引起的凝聚级联代表鲎用来对抗革兰氏阴性细菌入侵的一种重要的防卫机制。几十年来，变形细胞溶解物作为鲎变形细胞溶解物(LAL)试验的组成已被用作检测溶液中痕量浓度的内毒素(LPS)的工具。鲎中凝聚的分子机制已经被建立了，并且它与蛋白酶的级联有关。这个级联是基于3种丝氨酸蛋白酶酶原、C因子、B因子、凝固酶原以及一种可凝结蛋白、凝固蛋白原。作为凝固级联的最初激活剂，C因子作为对LPS作出反应的生物传感器。一旦C因子被LPS“激活”，产生的活性部分具有激活B因子和水解合成的三肽底物的能力。

C因子活性是用于飞克水平内毒素的非常敏感的分析的基础，其应用于制药产品以及诸如此类的产品的质量控制中。因此，C因子在内毒素检测中的重要性导致了作为可替代来源的重组C因子(rFC)的表达，这种可替代来源应该减轻用传统的变形细胞溶解物的公认的缺点，像内毒素检测灵敏度的季节性变动。

为了内毒素的特异性分析，C因子蛋白已被纯化和克隆。当被LPS激活时，重组C因子对存在于分析混合物中的合成底物起作用以产生可检测的信号，由此指示在指定样品中LPS的存在。具体地，荧光底物产生与所述样品中的内毒素浓度成比例的荧光信号。C因子蛋白已经被纯化和克隆以用于其在内毒素-特异性分析中的应用。

Nakamura等(1986,Eur.J.Biochem.154:511-521)描述了来源于中国鲎(Tachypleus tridentatus)的天然C因子蛋白的分离和特征。Muta等(1991，J.Biol.Chem.266:6554-6561)公布了编码来源于中国鲎(T.tridentatus)的C因子蛋白的cDNA序列。Ding等(1995，Molecular Marine Biology and Biotechnology 4:90-103)公布了编码来源于圆尾鲎(Carcinoscorpius rotundicauda)的C因子蛋白的cDNA序列。Roopashree等(1995,Biochem.Mol.Biol.Intl.35:841-849)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子在大肠杆菌中的重组表达。在此，108kDa的酶原的表达以及78kDa和52kDa的激活形式由免疫检测显示出来。

Ding等(1996,US专利5,858,706)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的重组表达。Roopashree等(1997,Biotechnology Letters 19:1147-1150)描述了来源于圆尾鲎(C.rotundicauda)的C因子蛋白在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的重组表达。