[发明专利]用于修饰的核苷酸的氧化剂

说明书

本发明涉及尤其是氧化剂的试剂，用于检测修饰的胞嘧啶残基、以及分析和/或测序包含修饰的胞嘧啶残基的核酸。

5-甲基胞嘧啶(5mC)是充分研究的、在基因沉默和基因组稳定性中起重要作用的表观遗传DNA标记，并发现其富集于CpG二核苷酸中(1)。在后生动物中，5mC可通过10-11易位(TET)家族的酶被氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)(2,3)。5hmC的整体水平大概比5mC的整体水平低10倍，并在组织之间变化(4)。相对高数量的5hmC(所有胞嘧啶～0.4％)存在于胚胎干(ES)细胞中，其中5hmC被认为在建立和/或维护多能性中发挥作用(2,3,5-9)。5hmC已被提议在活跃的DNA脱甲基中作为中间体，例如通过脱氨基，或经由利用TET酶进一步将5hmC氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5cC)、随后是涉及胸腺嘧啶-DNA糖基酶(TDG)的碱基切除修复或在复制中未被保持标记(10)。然而，5hmC本身也可构成表观遗传标记。

在总基因组DNA中，通过包括薄层色谱法和液相色谱-串联质谱法的分析方法检测和定量5hmC的水平是可能的(2,11,12)。因此，映射5hmC的基因组位置迄今为止是通过富集法实现的，该富集法采用用于DNA片段的5hmC特异性沉淀的化学物质或抗体，然后对DNA片段进行测序(6-8、13-15)。这些拉下(pull-down)方法具有相对较差的分辨率(10s至100s的核苷酸)，并且只给出相对的定量信息，这在富集中有可能受到分布式偏见。可量化的5mC的单核苷酸序列已使用重亚硫酸盐测序(BS-Seq)完成，所述重亚硫酸盐测序利用重亚硫酸盐介导的脱氨基作用将胞嘧啶转化为尿嘧啶，对应于这种脱氨基作用的5mC的转化是较慢的(16)。但是，人们已经认识到，5mC和5hmC在重亚硫酸盐反应中脱氨基都是很慢的，因此这两个碱基不能够被区分(17，18)。两个相对新的和简洁的单分子方法在单核苷酸分辨率中检测5mC和5hmC时显示出希望。单分子实时测序(SMRT)已经示出能在基因组DNA中检测衍生的5hmC(19)。然而，必须对包含5hmC的DNA片段进行富集，但该富集将导致定量信息损失(19)。即使SMRT具有较低的精确度(19)，但仍可通过其检测5mC。此外，SMRT具有相对高的测序错误比率(20)，且修饰的峰值呼叫(calling)是不精确的(19)，并且平台还不能测序整个基因组。蛋白质和固态纳米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用进一步的开发，有可能测序未扩增的DNA分子(21,22)。

已经报道了使用“氧化重亚硫酸盐”测序(“oxidative bisulfite”sequencing)(oxBS-Seq)的方法(23)在单核苷酸分辨率上对基因组DNA中的5hmC和5mC进行定量映射。这些方法涉及使用高钌酸钾(KRuO₄)将5hmC特异性氧化为5fC。

本发明的发明人已经意识到例如为钌酸根的金属(Ⅵ)氧基络合物(metal(Ⅵ)oxo complexe)在催化将多核苷酸中的5hmC残基选择性氧化为5fC残基时是有用的。例如，这在“氧化重亚硫酸盐”分析和测序的方法中可能是有用的。

一方面，本发明提供了一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法包括：

(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，

(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，

(ⅲ)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后

(ⅳ)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基。

在某些实施例中，所述残基可通过测序被识别。例如，一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法可以包括：

(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，

(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，

(ⅲ)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，

(ⅳ)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后

(ⅴ)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中的残基。

合适的测序方法在本领域中是已知的，并在下文详细描述。