[发明专利]用于人的间充质干细胞的无血清培养基

说明书

发明领域

本发明涉及用于生长和维持人类细胞的人工基质领域。本发明披露了一种专门为生长和维持人的间充质干细胞(hMSCs)而设计的新的、高度安全的、不含动物来源成分的培养基。

背景技术

细胞培养培养基被广泛用于生物活性制品，如激素，酶，抗原和抗体等的工业生产。细胞生长培养基通常是有机和无机来源细胞养分的混合物，分散或溶解在能够支持生物学有机体生长的液体或半固体系统中。

人的间充质干细胞(hMSCs)需要特别适合的生长培养基：这些生长培养基必须具有保持/支持MSCs分化成特定目标组织(血管，神经，脂质，骨质，软骨等)的能力，并且，所述能力对培养基组合物的变化十分敏感。鉴于MSCs被用于临床试验，以及将来将被用作先进的细胞治疗制品(ACTPs)，用于精致的治疗/化妆用途，如配制要植入患者体内的细胞悬浮液/组织/器官的制剂这一事实，对所述培养基进行微调同样是重要的。所述制剂要求具备GMP指南规定的可再现特征的精确而稳定的MSCs质量控制。所述培养基中不充分的MSCs生长/维持可能导致对患者具有潜在的严重后果的低质量移植，或者可能导致所述制剂的浪费和相关的成本损失。

所述MSC生长培养基还应当不含可能污染干细胞培养，并且被转移到患者体内的有毒成分：具体讲，所述生长培养基应当不含诸如血清等来源于动物的成分(常见于标准细胞生长培养基中)。血清是生长和维持哺乳动物细胞的通用营养成分；生长培养基通常含有高达大约10％的动物血清，如胎牛血清；尽管被广泛使用，血清的缺陷是包含可能的污染物，例如，病毒，如BSE(疯牛病)，即一种具有很长潜伏期或隐藏期的传染性牛神经变性疾病；这引起了有关将来自动物的血清用于生产生物学活性制品的管理方面的关注。

因此，对开发不含动物血清的替代培养基的需求持续增长。现有的商业制品部分满足了这种需求：事实上，从非常适合MSCs及其不同亚型角度来看，所述制品并非完全令人满意。

发明概述

本发明人业已获得一组高度有效的无血清生长培养基，特别适用于MSCs及其亚型，其特征在于包括溶解和/或悬浮在基础细胞生长培养基中的：

(a)选自下列一组的至少五种成分：人转铁蛋白，人胰岛素，硒或其盐，人甲状腺球蛋白，人白蛋白，抗坏血酸或其盐，丙酮酸或其盐，

(b’)一种或多种人类生长因子，和/或

(b”)一种或多种选自下列一组的添加剂：锶盐，维生素D，罗格列酮，前列腺素，BMP蛋白。

本发明还涉及制备上述培养基的方法，及其在培养人MSCs中的用途。

附图说明

图1：根据本发明的生长培养基中培养的人MSCs显微镜图像。在两个不同的融合阶段，以4X，10X或20X的放大倍数对细胞进行拍照。

图2：接种和培养SVF细胞的例子。A)接种72小时之后，可观察到粘附细胞。B)对相同的达到半融合的细胞进行洗涤之后。C)重新接种的细胞，自身排列形成所谓假岛(pseudo-islands)。D)在某些情况下，细胞可形成扁球形或不规则类型。

发明内容

在本发明中，所述基础细胞生长培养基优选为液体系统，即，不同成分的溶液和/或悬浮液；也可以使用诸如凝胶和类似形态的半固体培养基。所述基础细胞生长培养基可以从已知标准细胞培养基中广泛选择；所述培养基包含诸如无机盐，氨基酸，维生素等养分的混合物；优选的基础培养基是可通过商业渠道购买的制品DMEM(低或高葡萄糖Dulbecco Modified Eagle Medium)，HAM’s F-12，IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)及其混合物，优选以1：1的比例混合；至于混合物，特别优选的是：HAM’s F12/IMDM和HAM’s F12/DMEM。

至于成分(a)：所述人白蛋白优选为可注射人白蛋白；所述抗坏血酸盐优选为磷酸盐，例如，抗坏血酸-2-磷酸盐；所述丙酮酸盐优选为钠盐。

至于成分(b’)：所述人类生长因子优选选自bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，PDGF(血小板源生长因子，例如，PDGF-AB，PDGF-BB)，TGF(转化生长因子，例如，TGF-β1，TGF-β3)，EGF(表皮生长因子)。

至于成分(b”)：所述前列腺素优选选自PGE₂；所述BMP蛋白优选为BMP-6。

成分(a)与成分[(b’)和/或(b”)]的相互作用对于以下方面特别重要：

(i)使所述基础生长培养基适应MSCs生长；