[发明专利]通过在低PH下发酵产生有机酸

权利要求书

1.克鲁维酵母属的遗传改造的酵母细胞，其在低pH下耐受有机酸，其中从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的还原途径必需的酶以足以在厌氧或微需氧条件下产生琥珀酸作为发酵产物的水平存在于细胞质中，其中细胞质中运行的所述还原途径包含磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶并且编码所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶的至少一种基因插入丙酮酸脱羧酶基因座。

2.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含选自丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的额外羧化酶。

3.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化途径必需的胞质酶的一种或多种基因，其中在细胞质中运行的所述氧化途径包含选自丙酮酸激酶，丙酮酸脱氢酶，柠檬酸合酶，顺乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α-酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰-CoA合成酶的一种或多种异源酶并且编码所述异源酶的至少一种基因插入丙酮酸脱羧酶基因座。

4.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属或伊萨酵母属的酵母。

5.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自细菌基因。

6.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自埃希氏菌属、放线杆菌属、Mannheimia或Basfia属的细菌。

7.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中编码从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化和还原途径必需的所述胞质酶的一种或多种基因来自大肠杆菌基因。

8.权利要求3的遗传改造的酵母细胞，其中所述氧化途径和还原途径在不使用乙醛酸旁路的酶的情况下运转。

9.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述延胡索酸酶不含有铁硫簇。

10.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述延胡索酸酶由大肠杆菌fumC基因编码。

11.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述遗传改造的酵母细胞是代谢上进化的。

12.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其进一步包含在负责将琥珀酸从细胞质转运到线粒体中的二羧酸转运蛋白中的突变。

13.权利要求12的遗传改造的酵母细胞，其中所述二羧酸转运蛋白由DIC1基因或SFC1基因编码。

14.生产琥珀酸的方法，其包括培养权利要求13的遗传改造的酵母细胞并收获所述琥珀酸的步骤。

15.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其中所述遗传改造的酵母细胞进一步包含编码有利于还原当量在所述遗传改造的酵母细胞的线粒体和细胞质之间交换的蛋白质的至少一种基因。

16.权利要求15的遗传改造的酵母细胞，其中编码有利于还原当量在线粒体和细胞质之间交换的蛋白质的所述基因来自编码天冬氨酸-苹果酸穿梭的基因、编码甘油-3-磷酸脱氢酶穿梭的基因和编码醇脱氢酶穿梭的基因。

17.权利要求1的遗传改造的酵母细胞，其产生对FAD还原酶具有增加的活性的琥珀酸。

18.权利要求17的遗传改造的酵母细胞，其包含编码FAD还原酶的一种或多种异源基因。