[发明专利]FAD2性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白

权利要求书

1.一种将感兴趣的核酸序列整合到大豆细胞基因组中的特定位点的方法，该方法包括：

以位点特异性方式剪切大豆细胞中的FAD2基因的SEQ ID NO:14-20中任一者之内的靶位点，从而在该FAD2基因中产生断裂；

在该断裂中整合感兴趣的外来核酸序列。

2.权利要求1的方法，其中外来核酸序列是非编码序列。

3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述FAD2基因是FAD2 2.3、FAD2 2.6基因，或其二者。

4.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中位点特异性方式的剪切包括向细胞内引入融合蛋白或编码融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含DNA结合结构域以及剪切结构域或剪切半结构域，其中该融合蛋白与所述靶位点特异性结合，并在靶位点处或其附近进行剪切，从而产生断裂。

5.根据权利要求4的方法，其中该DNA结合结构域选自下组：大范围核酸酶DNA结合结构域，亮氨酸拉链DNA结合结构域，转录激活因子样(TAL)DNA结合结构域，RNA指导的CRISPR-Cas9，重组酶，锌指蛋白DNA结合结构域，和前述者的任何嵌合组合。

6.根据权利要求4方法，其中该剪切结构域或剪切半结构域选自下组：来自IIS型限制性核酸内切酶的剪切半结构域，来自FokI核酸内切酶的剪切半结构域，来自StsI核酸内切酶的剪切半结构域，和归巢核酸内切酶。

7.根据权利要求5或6的方法，其中该融合蛋白是锌指核酸酶。

8.根据权利要求7的方法，其中该锌指核酸酶包括5或6个锌指结构域，每个锌指结构域包括识别螺旋区，所述螺旋区标示为F1～F5或F1～F6，其中该锌指蛋白包括如下排序并显示的识别螺旋区：

(i)F1:QSSDLSR(SEQ ID NO:24)；

F2:RKDALVA(SEQ ID NO:25)；

F3:RSADLTR(SEQ ID NO:26)；

F4:RSDDLTR(SEQ ID NO:27)；

F5:RSDAMSQ(SEQ ID NO:28):及

F6:RNASRTR(SEQ ID NO:29)；

或

(ii)F1:DRSNLSR(SEQ ID NO:30)；

F2:HKWLRNQ(SEQ ID NO:31)；

F3:DSSDRKK(SEQ ID NO:32)；

F4:LRHHLTR(SEQ ID NO:33)；及

F5:QSGTRKT(SEQ ID NO:34)；

或

(iii)F1:QNAHRKT(SEQ ID NO:35)；

F2:LRHHLTR(SEQ ID NO:33)；

F3:QSGDLTR(SEQ ID NO:36)；

F4:QTSTLSK(SEQ ID NO:37)；

F5:TSGSLSR(SEQ ID NO:38)；及

F6:RSDHLTQ(SEQ ID NO:39)；

或

(iv)F1:RSDVLSE(SEQ ID NO:40)；

F2:RSADLSR(SEQ ID NO:41)；

F3:QSSDLSR(SEQ ID NO:24)；

F4:RTDALRG(SEQ ID NO:42)；

F5:LRHHLTR(SEQ ID NO:33)；及

F6:HRSARKR(SEQ ID NO:43)；

或

(v)F1:DRSHLTR(SEQ ID NO:44)；

F2:QSGNLHV(SEQ ID NO:45)；

F3:RSDHLSA(SEQ ID NO:46)；

F4:RSNLLVA(SEQ ID NO:47)；

F5:QSGALAR(SEQ ID NO:48)；及

F6:DRSALAR(SEQ ID NO:49)；

或

(vi)F1:QSSNLAR(SEQ ID NO:50):

F2:QSSDLRR(SEQ ID NO:51)；

F3:RSDTLSE(SEQ ID NO:52)；

F4:QSGHLSR(SEQ ID NO:53)；

F5:RSDVLST(SEQ ID NO:54)；及

F6:QNAHRIK(SEQ ID NO:55)；

或

(vii)F1:RSDNLSQ(SEQ ID NO:56)；

F2:ASNDRKK(SEQ ID NO:57)；

F3:RSDNLST(SEQ ID NO:58)；

F4:MRQHLLN(SEQ ID NO:59)；

F5:RSDNLAR(SEQ ID NO:60)；及

F6:QKKDRSY(SEQ ID NO:61)；

或

(viii)F1:RSDHLSR(SEQ ID NO:62)；

F2:DRSNRKT(SEQ ID NO:63)；

F3:RSDTLSA(SEQ ID NO:64)；

F4:DKSTRTK(SEQ ID NO:65)；

F5:QSGDLTR(SEQ ID NO:36)；及

F6:TSGSLTR(SEQ ID NO:66)；

或

(ix)F1:QSSDLSR(SEQ ID NO:24)；

F2:RKDALVA(SEQ ID NO:25)；

F3:RSADLTR(SEQ ID NO:26)；

F4:RSDDLTR(SEQ ID NO:27)；

F5:RSDSLSA(SEQ ID NO:67)；及

F6:RSDALAR(SEQ ID NO:68)；

或

(x)F1:DRSNLSR(SEQ ID NO:30)；

F2:HKWLRNQ(SEQ ID NO:31)；

F3:DSSDRKK(SEQ ID NO:32)；

F4:LRHHLTR(SEQ ID NO:33)；及

F5:RRDILHQ(SEQ ID NO:69)；

或

(xi)F1:RSDNLSQ(SEQ ID NO:56)；

F2:ASNDRKK(SEQ ID NO:57)；

F3:RSDNLST(SEQ ID NO:58)；

F4:MRQHLLN(SEQ ID NO:59)；

F5:QSGDLTR(SEQ ID NO:36)；及

F6:QRTHLKA(SEQ ID NO:70)；

或

(xii)F1:RSDHLSR(SEQ ID NO:62)；

F2:DRSNRKT(SEQ ID NO:63)；

F3:RSDVLSE(SEQ ID NO:40)；

F4:ARSTRTN(SEQ ID NO:71)；

F5:QSGDLTR(SEQ ID NO:36)；及

F6:TSGSLTR(SEQ ID NO:66)；

或

(xiii)F1:QSGNLAR(SEQ ID NO:72)；

F2:WRISLAA(SEQ ID NO:73)；

F3:DRSNLSR(SEQ ID NO:30)；

F4:WKESLGA(SEQ ID NO:74)；及

F5:HRKSLSR(SEQ ID NO:75)；

或

(xiv)F1:QSSDLSR(SEQ ID NO:24)；

F2:YHWYLKK(SEQ ID NO:76)；

F3:TSGHLSR(SEQ ID NO:77)

F4:TSGNLTR(SEQ ID NO:78)；及

F5:WWTSRAL(SEQ ID NO:79)。