[发明专利]具有靶向结合特异性的嵌合多肽

说明书

本发明公开了嵌合多肽，其组合物、表达载体、以及其用于产生转基因细胞、组织、植物和动物的使用方法。本发明的组合物、载体和方法在基因治疗技术中也有用。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2012年9月4日提交的美国序列号为61/696,689的申请、于2013年1月17日提交的美国序列号为61/753,763的申请以及于2013年5月1日提交的美国序列号为61/818,364的申请的优先权的利益，上述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及生物技术领域，并且更具体地涉及识别特异性DNA序列的嵌合重组酶。

背景技术

蛋白质以序列依赖性的方式识别DNA的能力对生命是至关重要的，因为各种蛋白质结构域已经发展到提供序列特异性DNA识别。由这些结构域中的少数几个的DNA识别也是各种各样的生物技术应用的基础。特别是，C₂H₂型锌指蛋白(ZFPs)是第一批被设计以识别用户定义的DNA序列的DNA结合蛋白质之一并且已被不同程度的成功用于许多应用，该应用包括转录调控、基因组工程和后天修饰。ZFPs的模块化装配促进了这些方法。然而，尽管ZFP技术取得了进步且具有前景，但是对某些序列的特异性、高亲和性ZFPs的构建仍然困难并且在选择的情况下，需要使用不易被非专业实验室采用的耗时和劳动密集型的选择系统。

转录激活子样效应因子(TALE)结构域是代表ZFP技术的可能的替代方案的一类天然存在的DNA结合结构域(DBD)。被发现于植物病原体黄单胞杆菌属中的TALE包含一系列的33至35个氨基酸重复序列，该重复序列发挥功能以选择性地结合靶DNA序列。这些重复序列除了两个相邻的重复可变二残基(RVD)之外是相同的，该重复可变二残基通过介导结合到单个的核苷酸而赋予DNA特异性。已经描述了结合到DNA位点的类似数目的碱基对(bp)的超过30个重复序列的阵列。虽然每个RVD的结合中固有简并性，但是最近的报告表明，合成的TALE蛋白质具有足够的特异性以靶向人类基因组内的单个位点。

通过嵌合核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN))引入DNA双链断裂(DSB)可以用来敲除基因功能或者在外源添加的DNA的存在下驱动在目标位点的盒整合。在过去十年中，ZFN已被广泛研究，并且在某些情况下，正在接近临床应用进行基因治疗。最近，一些团体已经探索了利用将TALE DNA结合结构域与核酸酶(TALEN)融合进行靶向基因组编辑。事实上，许多使用ZFN的工作已使用TALE核酸酶来复制，因为较之ZFN，TALEN可具有关于DNA结合模块化的优点。然而，尽管对ZFN和TALEN进行了令人印象深刻的研究，还仍然存在关于其安全性和特异性的问题。特别是，脱靶裂解事件仍难以检测，脱靶DSB最有可能的结果是引入小插入或小缺失。此外，DSB的修复依赖于随细胞类型而变化的细胞机制。

一个实现靶向基因组修饰的替代方法是使用位点特异性重组酶(SSR)。诸如酪氨酸重组酶Cre和Flp之类的SSR是被常规用于操纵在细胞内的染色体结构的有价值的分子生物学工具。因为这些酶依赖于若干复杂的蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用以协调催化，SSR表现出显著的靶位点特异性。然而，迄今为止，已经证明许多SSR的特异性的改变非常困难。解离酶型/转化酶型丝氨酸重组酶为酪氨酸重组酶进行基因组工程提供了灵活多样的可变性。在自然界中，这些酶具有以高度模块化的方式协调重组的多域蛋白复合物的功能。然而，几种丝氨酸重组酶突变体已经确定不需要用于重组的辅助因子。此外，许多研究已经表明，丝氨酸重组酶的天然DBD能够被定制设计的ZFP代替，以产生嵌合锌指重组酶(ZFR)。原则上，可以产生能够识别扩展数目的序列的ZFR，但是，由于缺乏能够识别所有可能的DNA三联体的锌指结构域，导致限制这些酶的潜在的模块化靶向能力。