[发明专利]评价内体运输的测定

权利要求书

1.评价测试分子的内体释放能力的测定，所述测定包括：

i)使真核细胞与有待评价内体释放能力的测试分子接触，其中所述真核细胞包含细胞膜，其包括存在于所述细胞的细胞膜外表面上的结合位点；

ii)使测试分子与所述真核细胞温育，并由此允许

a)测试分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；

b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有测试分子；和

c)所述测试分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；

iii)除去未与存在于真核细胞上的结合位点结合的过量测试分子；

iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的测试分子的量；

v)将步骤iv)中检测到的测试分子的量与对照值相比较，其中所述对照值代表在步骤iv)之前存在于所述一个或多个内体中的测试分子的量或存在于胞质中的测试分子的量；

vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的测试分子的量的相对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的测试分子的量的相对变化，计算测试分子的内体释放值。

2.权利要求1的测定，其中所述真核细胞选自：酵母细胞，昆虫细胞，脊椎动物细胞，哺乳动物细胞，植物细胞和真菌细胞。

3.权利要求1或2的测定，其中所述测试分子选自：梭菌神经毒素，靶向分泌抑制剂，antarease蛋白酶，IgA蛋白酶，或其组合。

4.前述权利要求任一项的测定，其中温育步骤ii)进行从5分钟到5天的时间段，如1-12小时或2-10小时或4-8小时或6-8小时。

5.前述权利要求任一项的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后5分钟到5小时之间进行，如在步骤iii)之后15-240分钟或30-180分钟或45-150分钟。

6.评价阻断分子对真核细胞中的内体运输的抑制效应的测定，所述测定包括：

i)使真核细胞与结合所述真核细胞表面上存在的结合位点的对照分子接触，其中所述对照分子与结合位点形成结合复合物，通过内吞进入真核细胞，在此期间形成含有对照分子的内体，并且其中所述对照分子通过穿越内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；

ii)使对照分子与所述真核细胞温育，并由此允许

a)对照分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所述结合复合物通过内吞进入真核细胞；

b)一个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有对照分子；和

c)所述对照分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；

iii)使真核细胞与有待评价其遏制对照分子从内体释放的能力的测试抑制剂分子接触；

iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的对照分子的量，或者检测存在于所述真核细胞的胞质中的对照分子的量；

v)将步骤iv)中检测到的对照分子的量与对照值相比较，其中所述对照值代表在步骤iii)之前存在于所述一个或多个内体中的对照分子的量或存在于胞质中的对照分子的量；

vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的对照分子的量的相对变化，或者通过确定存在于所述真核细胞胞质中的对照分子的量的相对变化，对测试抑制剂分子赋予抑制值。

7.权利要求6的测定，其中所述真核细胞选自：酵母细胞，昆虫细胞，脊椎动物细胞，哺乳动物细胞，植物细胞和真菌细胞。

8.权利要求6或7的测定，其中所述对照分子选自：梭菌神经毒素，靶向分泌抑制剂，antarease蛋白酶，IgA蛋白酶，或其组合。

9.权利要求6-8中任一项的测定，其中温育步骤ii)进行从5分钟到5天的时间段，如1-12小时或2-10小时或4-8小时或6-8小时。

10.权利要求6-9中任一项的测定，其中检测步骤iv)在步骤iii)之后5分钟到5小时之间进行，如在步骤iii)之后15-240分钟或30-180分钟或45-150分钟。

11.权利要求6-10中任一项的测定，其中接触步骤ii)在开始温育步骤ii)之后5分钟到5天之间进行，如在开始温育步骤ii)之后30分钟到12小时之间或30分钟到10小时之间或30分钟到8小时之间或1-8小时之间。