[发明专利]新型偶氮化合物及其利用、以及其制造方法

说明书

本发明提供一种对受激能级状态下表现出发光现象的物质具有猝灭能力的新型偶氮化合物、含有新型偶氮化合物的猝灭剂、该猝灭剂的利用以及偶氮化合物的制造方法。本发明的猝灭剂在波长的吸收区域中显示出优异的特性。

技术领域

本发明涉及一种新型偶氮化合物、含有上述偶氮化合物的新型猝灭剂、 上述猝灭剂的利用以及上述偶氮化合物的制造方法。

背景技术

关于荧光共振能量转移(FRET)的猝灭现象是指，从因光而处于受激能 级状态的作为报告体(reporter)的能量给体中，能量转移到位于近距离的作 为猝灭剂的能量受体的现象(J.R.Lakowicz，Principles of fluorescence spectroscopy，1999，KluwerAcademic/Plenum Publishers，New York)。此时， 能量转移效率与报告体和猝灭剂之间的距离密切关联，转移效率与报告体和 猝灭剂之间距离的6次方成反比例关系。因此，此两者之间的距离相隔一定 距离以上时，不会发生荧光共振能量转移(FRET)猝灭现象。

作为荧光共振能量转移猝灭现象的一例，将TAMRA荧光物质作为能量 受体使用时，即，作为猝灭剂使用时，来自能量给体的发光能量能够在能量 受体的吸光区域内进行吸收。所吸收的能量转变成受激能级状态，并在能量 受体的发光区域内发光。

如上所述的猝灭现象在由偶氮化合物构成的猝灭剂的情况下，其能量转 移过程也相同。但是，在作为能量受体的猝灭剂中不会发生发光现象。该转 移过程中的偶氮化合物等猝灭剂代替发光以热或其他作用方式释放能量，其 在该方面上与前述物质有所不同。将上述偶氮化合物等猝灭剂称为暗猝灭剂 (Dark quencher)。

暗猝灭剂在转移能量时不以光的形式释放能量，而是以热的形式释放能 量，因此，其是不带有荧光的染料。显示荧光的猝灭剂在分析时，猝灭剂与 报告体的荧光光谱重叠，从而增加了背景噪音。但是，暗猝灭剂没有荧光光 谱而不存在噪音问题，因此对于上述的增加背景噪音的缺点提供了解决方案。 另外，暗猝灭剂还可以提供同时使用两个以上的报告体-猝灭剂的探针的优 点。

作为具有暗猝灭剂的结构的代表性化合物，典型的有BHQ猝灭剂衍生物 的BHQ1、BHQ2以及BHQ3(WO2001/086001A1)。这些猝灭剂由作为电 子给体物质的二烷基苯胺和具有电子受体性质的芳香族物质之间的重氮键构 成，大约在500700nm的波长区域中吸收荧光。但是，具有盐结构的猝灭 剂的情况下，低聚物合成和提纯过程时表现出不稳定的状态，BHQ3为其一 例。

此外，可例举：BBQ猝灭剂(WO2006/084067A2)和作为醌类猝灭剂的 爱荷华黑猝灭剂(Iowa black猝灭剂)(US7504495B2)。但是，这些猝灭剂 相比于上述BHQ猝灭剂波长吸收能力差。

一方面，猝灭剂与荧光物质相结合而主要在化学或者生物学领域中使用。 为了检测所需的分子、蛋白质或核酸，使能够与其互补性结合的分子、猝灭 剂以及荧光物质相结合而测定荧光的发光程度，由此能够判断出目标物质的 存在。其对化学以及生物学领域的进一步发展起到了重要作用。生物学领域 中最有效应用荧光共振能量转移理论的是，即时聚合酶链锁反应(Real Time Polymerase Chaine Raction，RT-PCR)中探针的使用。探针用于碱基序列等特 定部位的检测，最近在即时聚合酶链锁反应(RT-PCR)中频繁使用。

探针的种类有TaqMan探针和分子信标(Molecular Beacon)探针等。 TaqMan探针是，一侧端部上附着有报告体(能量给体)，相反侧端部上附着 有猝灭剂的探针。进行聚合酶链锁反应时，报告体脱离猝灭剂影响的同时显 现出报告体本身的荧光。荧光的量随着聚合酶链锁反应更多实施，成比例地 增加。通过定量化该荧光的量而用作间接的测定手段。分子信标探针以发夹 形状由茎和环构成。随着聚合酶链锁反应的进行，特定部位上附着有分子信 标探针时，结构分解，并且脱离猝灭剂的影响范围而发出荧光。