[发明专利]新的RIG‑I配体及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及可以作为RIG-I配体起作用的新的三磷酸-修饰的寡核苷酸以及能够以高收率和纯度合成和纯化的适合于药物应用的新方法。

背景技术

Schlee等人,Immunity,2009,31,25-34描述了在一条链上携带5’-O-三磷酸酯部分的钝端双链RNA，通过结合RIG-I解螺旋酶，作为有效的免疫系统的刺激剂。因此，对提供简单且有效的用于制备适用于药物应用的高纯度三磷酸修饰的寡核苷酸的方法存在需求。

三磷酸基团或其类似物与核苷化合物的5’-OH基团的偶联是本领域公知的。Ludwig J.等人,J.Org.Chem.,1989,54,631-635公开了使用2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷(benzodioxaphosphorin)-4-酮作为亚磷酸化剂的用于制备核苷和类似物的5’-O-三磷酸酯的溶液三磷酸化方法。Gaur R.K.等人,1992,Tetrahedron Letters,33,3301-3304描述了在固相上使用所述方法，用于合成2’-O-甲基核糖核苷5’-O-三磷酸酯及其P_α-硫代类似物。美国专利6,900,308B2公开了作为潜在抗病毒化合物的修饰核苷5’-O-三磷酸酯的固相合成，而美国专利7,285,658、7,598,230和7,807,653公开了在糖、核酸碱基和三磷酸实体上具有修饰的核苷三磷酸酯类似物。

WO96/40159描述了用于生产加帽的RNA或RNA类似物分子的方法，其中将RNA或RNA类似物寡核苷酸与亚磷酸化剂(如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮或其环取代的衍生物)反应。将所得到的中间体与磷酸酯或焦磷酸酯或其氧化的或水解的盐反应。通过与激活的m⁷G三-、二-或单磷酸酯或类似物反应，将二-或三磷酸化RNA或RNA类似物加帽。

WO 2009/060281描述了含有修饰的寡磷酸酯部分的免疫刺激寡核糖核苷酸类似物和用于制备这些化合物的方法。该方法包括在固体支持物上合成寡核苷酸，在适合的溶剂中，并且在碱的存在下，在寡核苷酸的5’-端，将核苷酸与亚磷酸化剂(如，2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮)反应，将亚磷酸化的寡核苷酸与焦磷酸酯或焦磷酸酯类似物反应，用氧化剂氧化寡核苷酸，并且将寡核苷酸去保护，以产生三磷酸酯-或三磷酸酯类似物-修饰的寡核苷酸。

WO 96/40159中使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳只可用于小规模分离。用于较长寡核糖核苷的5’-单-、二-、三磷酸化产品的离子交换色谱的分辨力受到限制。所需的变性条件使得分离是个冗长乏味的任务(Sproat,1999；Zlatev,2010；WO 2009/060281)，此外，产品通常受到正-1、正-2序列及其单-和二磷酸酯的污染，导致纯度不足。已知对RIG-I配体的精确末端结构的敏感性，这些纯化方法对药物应用是次最佳的。

因此，对于新的三磷酸化寡核苷酸及其类似物、特别是具有RIG-I选择性的新的三磷酸化寡核苷酸及其类似物以及这样的化合物的制备方法存在高度需求。

发明内容

本发明由此涉及新的可以用于大规模生产的可能用于临床应用的5'-三磷酸化寡核苷酸及其类似物以及这样的寡核苷酸的便利制备方法。此外，描述了寡核苷酸修饰，其建立、维持和/或改善寡核苷酸的RIG-I选择性或增强其化学稳定性。

因此，本发明的第一个方面涉及式(I)的修饰的寡核苷酸，

其中V₁、V₃和V₅在每种情况中独立地选自O,S和Se；

V₂、V₄和V₆在每种情况中独立地选自OH、OR¹、SH、SR¹、F、NH₂、NHR¹、N(R¹)₂和BH₃^-M⁺；

W₁是O或S；

W₂是O、S、NH或NR²；

W₃是O、S、NH、NR²、CH₂、CHHal或C(Hal)₂；