[发明专利]环节动物血红蛋白冷冻干燥法

说明书

技术领域

本发明涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法，以及所获得的冻干物。

背景技术

环节动物的细胞外血红蛋白作为血液代用品，可能治疗与缺氧相关的问题。

术语“血液代用品”的意思是指可以通过提供氧载体来补偿出血后失血的任意产品或溶液。血液代用品不同于人造血，因为血液代用品不能完成血液提供的所有功能，例如激素运输。

目前，已知两种药物类的替代品：它们是全氟化碳(PFCs)和血红蛋白氧载体(HBOC)。

PFC是允许O₂以溶解在血液中的形式运输至组织的化学合成化合物。

HBOC来自于牛HB或人HB(后者来自过期的血袋)的纯化后化学修饰，或通过基因工程合成得到。

为储存HBOC，传统的方法是在溶液中调节血红蛋白分子。为保证更好的稳定性，在某些情况下，需要在使用前将其储存于-20℃和-80℃之间。然后用干冰运输以确保其不会解冻。这些各种条件涉及额外的成本和更严格的储存和运输物流，证明其对于某些应用是有限制性的。

因此，需要一种包括在没有致冷条件的远程环境下容易储存和运输的功能性血红蛋白。

一种解决的办法是冷冻干燥法。

然而，初步研究表明血红蛋白分子在冷冻干燥过程中部分降解，因此特别地损害其功能性，即其可逆地结合氧的能力。此外，这在蛋白质文献中也有总体描述(Heller Martin.C,Carpenter John.F,Randolph Theodore.W,“Protein Formulation and Lyophilization Cycle Design:Prevention of Damage due to Freeze-Concentration Induced Phase Separation”Biotechnology and Bioengineering,Vol 63,No.2,1999)。

本发明人发现了，令人惊讶的是，环节动物的细胞外血红蛋白，当与特定的稳定剂混合时，能被冻干的同时保持其四级结构、其功能性以及其功效。

发明内容

因此，本发明涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法。本发明还涉及所获得的冻干物。事实上后者可以将环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白及其珠蛋白原聚体以经济实用(例如，需要最小的空间)的形式储存，并同时保持该血红蛋白的结构和功能性质。

本发明的冻干物包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白，和选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂。

本发明还涉及一种组合物，其包含：

-含有环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的溶液，和

-选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂，优选地选自海藻糖和抗坏血酸。

环节动物的细胞外血红蛋白在三类环节动物中存在：多毛纲、寡毛纲和无毛纲。提及细胞外血红蛋白是因为其不是天然地包含在细胞中，且因此可以在血流中自由循环，而不需化学修饰以使其稳定或使其起作用。

环节动物的细胞外血红蛋白是分子量为2000至4000kDa的巨大生物聚合物，其由一般分为两个类别的4至12种不同类型的大约200个多肽链组成。

第一类有144至192个组分，组合成为带有血红素类型活性位点且能可逆地结合氧的“功能性”多肽链；这些是珠蛋白类型的链，其重量为15至18kDa，且其与脊椎动物的α-和β-型链非常相似。

第二类有36至42个组分，组合成为具有很少或没有活性位点但能够使亚单元组装在一起的“结构性”或“接头”多肽链，所述亚单元称为十二分之一亚单元或原聚体。

每个血红蛋白分子由两个叠加的六角形构成，其被称为六角形双层且每个六角形本身由水滴形式的六个亚单元组装形成(或“十二分之一亚单元”或“原聚体”)。该天然分子由十二个这些亚单元(十二具体或原聚体)构成。每个亚单元的分子量在200和250kDa之间，并构成该原始分子的功能性单元。

优选地，环节动物的细胞外血红蛋白选自多毛纲环节动物的细胞外血红蛋白，优选沙蠋科(Arenicolidae)的细胞外血红蛋白和沙蚕科(Nereididae)的细胞外血红蛋白。甚至更优选地，所述环节动物的细胞外血红蛋白选自海沙蠋(Arenicola marina)的细胞外血红蛋白和沙蚕属(Nereis)的细胞外血红蛋白，更优选海沙蠋的细胞外血红蛋白。