[发明专利]体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法

权利要求书

1.体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法，其是通过在体外维持、扩增、培养多能干细胞，使其定向分化为心室肌细胞，其特征在于，在多能干细胞分化的中期即由中胚层细胞或心肌前体细胞向心肌细胞分化的时期，向培养基中加入可直接或间接激活Smad1/5/8信号通路的物质；

其中，所述可直接或间接激活Smad1/5/8信号通路的物质为骨形态发生蛋白2(BMP2)和/或骨形态发生蛋白4(BMP4)，其终浓度为0.01-1200ng/mL；

所述多能干细胞为来自于哺乳动物的胚胎干细胞，或诱导的多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在多能干细胞分化的初期，向培养基中加入具有促进心肌细胞分化的物质；其中，多能干细胞分化的初期是指从干细胞分化成中胚层细胞的时期。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述具有促进心肌细胞分化的物质为BMP4、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、激活素A(Activin A)、Noggin、Dorsomorphin、6-溴靛玉红-3'-肟(6-bromoindirubin-3′-oxime，BIO)中的至少一种；

其中，添加的生长因子的终浓度为0.01-1200ng/mL，其它物质的终浓度为0.001-100μM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在多能干细胞分化的中期，还向培养基中添加具有抑制Wnt信号通路的物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述具有抑制Wnt信号通路的物质为dickkopf同源物1(dickkopf homolog 1，DKK1)、IWP、Wntresponse的抑制剂(IWR)中的至少一种；其中，添加的DKK1的终浓度为0.01-1200ng/mL，其它物质的终浓度为0.001-100μM。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在多能干细胞分化的中期，还包括i)当培养基中不含有维甲酸或其合成所需的底物时，向其中加入维甲酸受体γ(RARγ)的激活剂；或ii)当培养基中含有维甲酸或其合成所需的底物时，向其中加入维甲酸受体α(RARα)和/或维甲酸受体β(RARβ)的拮抗剂；

其中，i)中所述激活剂和ii)中所述拮抗剂的终浓度范围为0.001-100μM。

7.促进干细胞分化为心室肌细胞的方法，该方法包括激活中胚层细胞中的Smad1/5/8信号通路；其中，所述中胚层细胞由干细胞分化而来；

使中胚层细胞与BMP2和/或BMP4接触从而激活Smad1/5/8信号通路；BMP2和/或BMP4使用的终浓度为0.01-1200ng/mL；

其中，所述干细胞为哺乳动物胚胎干细胞、诱导的多能干细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干细胞为哺乳动物全能干细胞(Totipotent stem cell)。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干细胞为诱导的人多能干细胞。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，由干细胞分化成中胚层细胞是通过使未分化的干细胞与以下物质中的至少一种发生接触；所述物质为bFGF、BMP2、BMP4、Activin A、BMP拮抗剂、BMP信号通路抑制剂、Wnt3a信号通路激活剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述BMP拮抗剂为BMP4拮抗剂。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述BMP拮抗剂为Noggin。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述BMP信号通路抑制剂为Dorsomorphin。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述Wnt3a信号通路激活剂为GSK-3α/β的ATP-竞争性抑制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述GSK-3α/β的ATP-竞争性抑制剂为靛玉红化合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述靛玉红化合物为BIO。