[发明专利]制备重组人酪氨酸酶的方法

说明书

本发明涉及制备酶促活性的重组人酪氨酸酶的方法。这已经通过本发明通过克隆和使用昆虫细胞过表达（重组）人酪氨酸酶来实现。

发明领域

本发明涉及制备酶促活性的重组人酪氨酸酶的方法。本发明更具体涉及包括克隆和使用昆虫细胞过表达（重组）人酪氨酸酶的方法。

发明背景

酪氨酸酶是已知涉及黑色素形成的酶。在过去已经通过搜寻安全和有效的酪氨酸酶抑制剂鉴定了很多皮肤美白活性物。在进行体外测定以确定酪氨酸酶抑制和研究酶动力学中，蘑菇酪氨酸酶已成为最频繁使用的酶，而人和小鼠黑素细胞裂解物的使用程度较小。这是因为蘑菇酪氨酸酶可大量地获得，相对廉价并且易于使用。然而，蘑菇酪氨酸酶与人酪氨酸酶非常不同，并且已经认识到在这样的研究中使用蘑菇酪氨酸酶可能导致关于活性物（如在人中的皮肤美白剂）的潜力的错误信息。因此，优选使用人酪氨酸酶。然而，在供应充足量的和具有可接受的酶促活性的人酪氨酸酶中存存问题。这已经通过使用来自人黑素细胞的裂解物在一定程度上克服。

人黑素细胞裂解物由于其作为几种蛋白质的混合物而固有的复杂性质和因此当用于测定中时导致不可预测的表现受到负面评价。酪氨酸酶的纯化由于多步骤的层析方法导致低产量。因此，存在对制备高产量的、高纯度的和相关酶促活性的人酪氨酸酶的更好方法的需求。

重组人酪氨酸酶的商业来源是可获得的（例如 Enzo Life Sciences），但是本发明人已发现其酶促活性相比于等量的人黑素细胞裂解物是低的。因此，其不能如作为实施皮肤美白活性物筛选的合适的酶来有效地且可重复地使用。人酪氨酸酶的截短形式或片段可从其它商业来源获得，但是本发明人已发现它们不适合于酶促测定。这可能是由于它们中的很多是细菌表达的，并且缺少糖基化，所述糖基化对稳定性和活性是关键的。因此，发现细菌表达的人酪氨酸酶（其中在文献中存在若干公开）不适合用于酶促测定目的，其必须是足够地可重复的，以能够有效筛选用于皮肤美白的活性物。

WO90/12869 (Sloan Kettering)公开了组成型表达有生物活性的人酪氨酸酶的非黑素细胞真核细胞。本发明人已经确定如此表达的酪氨酸酶必须通过破坏成纤维细胞来制备，并且因此产量和纯度是相当低的。

Dolinska等人：“Human modified tyrosinase and two temperature-sensitivemutants are soluble active enzymes”, ARVO 2012 Abstract Search & ItineraryBuilder, 2012年5月7日 (2012-05-07), 页Session No. 231, XP002688743公开了截短的人酪氨酸酶（残基19 – 469）的表达，其被工程化为合成的密码子优化的DNA序列并且克隆至杆状病毒中。

本发明人已经开发出制备重组人酪氨酸酶的方法，其中产物更容易纯化并且以强劲的方式(in a robust manner)展示出生物相关的酶促活性。

因此本发明的目标是开发以高产量和纯度制备人酪氨酸酶的方法。

本发明的另一个目标是开发以高产量和纯度制备人酪氨酸酶的方法，其易于扩大规模以大量制备它们用于商品化生产。

本发明的还另一个目标是开发制备人酪氨酸酶的方法，从而当用于酶测定时，技术人员能够获得高度可重复的结果。

发明概述

根据本发明，提供了制备重组人酪氨酸酶的方法，其包括步骤

(i) 使用PCR以密码子优化的方式合成制备界定为从对应蛋白质的N-末端延伸至其473位氨基酸或更高的全长人酪氨酸酶基因；

(ii) 克隆所述基因至杆状病毒表达系统中；

(iii) 从所述克隆制备杆粒；

(iv) 用所述杆粒感染昆虫细胞以制备病毒滴度；和