[发明专利]细胞培养物上清液的过滤

说明书

本发明涉及用于分离液体上清液和细胞的方法，其包括步骤：提供细胞与液体的混合物，用所述混合物充装第一滤器盒，其中在所述滤器盒中，在筛状穿孔的平的基底面上提供具有4µm‑50µm的孔径的滤器，并且所述滤器盒的壁紧密地与筛状穿孔的平的基底面相连，向所述混合物施加至少0.5 bar的差压，由此将所述混合物的液体部分挤压穿过滤器，并且含有细胞的滤饼保留在滤器盒中，和移除经过滤的液体。

本发明涉及用于过滤细胞培养物上清液的方法。

使用用于生产目的的生物技术方法产生了生产这样的物质的重要机会，所述物质无法或无法经济地通过其他方法例如通过化学合成来生产，并且作为原料在自然中无法以足够量获得。植物材料的生产目前集中于次级代谢物，其中重组表达产物的比例稳步上升。大规模生产主要集中于植物细胞培养物或植物。植物中DNA转移的可能性也意味着对植物成分的定量以及定性修饰是可能的。此外，植物和植物细胞培养物在生产异源蛋白中是令人感兴趣的(Fischer 等人, Current Opinion in Plant Biology 2004, 7:1-7)。

一种策略涉及在完整转基因植物中生产异源蛋白。如上所述作为实例的使用完整植物的一个根本性不利因素在于需要其耗时且高成本的培养以及工业生成规模所需的大面积栽培。此外，从完整植物中纯化期望的目标物质通常需要复杂的方法步骤，尤其是当对产物的外观和品质具有高要求时，以及物质用于药物或营养生理目的的情况。

在第二种策略中，将转基因植物细胞培养物用于生产抗体。公知的实例是表达抗体或其他哺乳动物蛋白(Huether等人, Plant Biol. 2005, 7: 292-299)及其分泌入培养基中。由于从细胞中纯化异源蛋白成本非常高，因此目标蛋白分泌入培养基构成了重大改进。此外，安全性考虑也倾向于在细胞培养物中生产重组的药学上相关的蛋白，这是由于转基因植物细胞可以排他地在生物反应器中培养并且无需释放。以更大规模用于异养植物细胞培养物的生物反应器的开发已使得所需的大规模培养成为可能。

对于进一步的产物纯化，在第一步中，生物质需要从上清液中分离。为此，已知多种过滤方法。在重组分泌蛋白的情况下，产物存在于培养物上清液中。因此，目的是在分离的生物质部分中保留尽可能少的残余水分/上清液，以避免产物的损失。多种实验室规模的过滤方法是已知的。Buettner-Mainik Annette等人 (Plant Biotechnology Journal 9(3) (2011):373-383)描述了在小立碗藓(P. patens)中生产人因子H。使用吸滤器在真空下通过织物分离含水的细胞培养物。获得的产物是潮湿的并且需要进行干燥。Lucumi等人(Process Biochemistry 41 (10) (2006):2180-2187)描述了在小立碗藓生物反应器中生产rh VGEF过程中交叉流过滤。Marta Fernandez Nunez (E-Dissertation, HamburgUniversity (2010), p 48, Chapter 2.11.1)描述了在小立碗藓中细胞分裂素概况分析(Cytokinin-Profiling)过程中的真空过滤。Fischer Rainer等人(Journal ofImmunological Methods 226 (1-3) (1999):1-10)涉及在过滤后湿润的烟草愈伤组织培养物的真空过滤。WO 2005/108596 AI涉及通过在植物细胞中表达的具有胱氨酸结的环肽的体外合成。用吸滤器在真空下分离细胞悬浮液。Kim Sun Tae等人(Proteomics 9 (5)(2009):1302-1313)描述了稻细胞与真菌稻瘟病菌(M. grisea)在悬浮液的共培养。通过真空过滤进行分泌蛋白的分离。Ndimba Bongani K. (Proteomics 3 (6) (2003):1047-1059)涉及检查在悬浮培养物中的拟南芥中的细胞外基质中的变化。将真空过滤用于研究培养物上清液。

一个具体问题是在植物和植物细胞培养物中，与动物细胞和细菌的方法不同，固体残余物例如在过滤的情况下的滤饼占了相当大的体积。因此，大量的上清液与其在一起并被保留下来。因此，本发明的一个目的是改进固体生物质与培养物上清液的分离。