[发明专利]5’保护依赖性扩增

权利要求书

1.用于从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

a)获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，

b1)将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或b2)提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，

c)修饰在模板链的5’端或互补链的3’端或两者上无5’保护基团的所述核酸的延伸产物，和

d1)标记步骤c)中未被修饰的双链核酸的互补核酸，其中由此标记的核酸具有在步骤c)中的RNA模板链上的5’保护基团，所述5’保护基团在执行完步骤c)后被任选地移除由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

2.用于从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：

a)获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，

b1)将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或b2)提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，和

d2)基于互补核酸模板RNA链上5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接，标记双链的互补核酸，由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述保护基团是5’帽或5’聚磷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述标记包含将核酸序列标签与步骤c)中未被修饰的所述双链核酸连接。

5.权利要求4的方法，其中所述核酸序列标签至少部分是双链的。

6.权利要求4的方法，其中所述核酸序列标签在连接端。

7.权利要求1的方法，其中所述修饰防止所述被修饰的双链的标记。

8.权利要求1的方法，其中步骤c)中的所述修饰选自i)5’-3’外切核酸酶消化不加帽核酸；ii)将模板链的5’端连接至互补链的3’端；iii)添加缺少用于未被修饰双链核酸的所述标记的核酸序列标签；或iv)移除模板链上的5’末端磷酸。

9.权利要求8的方法，其中通过磷酸酶移除模板链上的5’末端磷酸。

10.权利要求8的方法，其中RNA仍旧含有5’保护基团，因此被保护免于5’去磷酸化。

11.权利要求1的方法，其中未被修饰的双链核酸的互补核酸在3’端被标记。

12.权利要求11的方法，其中互补链的3’末端核酸与具有5’末端核苷酸的模板链在所述5’末端核苷酸的0或1个核苷酸内退火。

13.权利要求11的方法，其中互补链的3’末端核酸与具有5’保护基团的模板链在所述5’保护基团的0或1个核苷酸内退火。

14.权利要求12的方法，其中所述5’末端核苷酸是5’聚磷酸。

15.权利要求13的方法，其中所述5’保护基团是5’帽。

16.权利要求1或2的方法，其中所述标记对双链是特异性的。

17.权利要求16的方法，其中所述双链是具有平端或具有最多1个核苷酸突出端的末端的双链。