[发明专利]微生物分析的设备和方法

说明书

相关申请的交叉引用

该申请要求于2013年4月30日提交、申请序列号是No.13/874213的美国专利申请“Apparatus and methods for microbiological analysis”的优先权。该申请还要求于2012年5月1日提交的，发明人是James L.Stephenson、Jr.，Oksana Gvozdyak、Roger Grist、Clay Campbell和Ian D.Jardine，申请序列号是No.61/687785的美国临时专利申请“Apparatus and methods for microbial analysis and directed empiric therapy”的优先权，通过引用将其全文结合至本公开。

背景技术

近年来，质谱分析与传统的鉴定微生物的方法相比，由于其准确性提高，获得结果的时间缩短，成为流行的鉴定微生物的手段。到目前为止，微生物鉴定中最常用的质谱分析方法是基质辅助的激光解吸附离子化时间飞行(MALDI-TOF)质谱分析。在MALDI-TOF中，未知微生物细胞与合适的紫外光吸收基质溶液混合，并在样品板上干燥。或者，用微生物细胞的提取物取代完整细胞。转移至质谱仪的离子源之后，激光束照射至样品进行蛋白质的解吸附和离子化，并收集随时间变化的质谱数据。

MALDI-TOF法产生的微生物的质谱显示了来自完整肽、蛋白质和蛋白质片段的大量尖峰，其构成了该微生物的“指纹”。该方法依赖于未知微生物的质谱尖峰图与参考数据库的匹配，所述参考数据库包括采用基本相同的实验条件所获得的已知微生物的图谱集合。分离的微生物和参考数据库中的某个图谱的匹配越好，则将该微生物鉴定是属、种、(或在某些情况下)亚种级的可信度就越高。由于该方法依赖于MALDI-TOF质谱中尖峰图的匹配，其不需要鉴定或者另外表征在该未知微生物图谱中表示的蛋白质以鉴定该微生物。

尽管MALDI-TOF法快速、成本高效，其仍然具有缺陷从而限制了其应 用范围。基质辅助激光解吸附离子化(MALDI)质谱中的信息内容反映了含量最高的、可离子化的蛋白质，除了病毒，在所采用的实验条件下，所述蛋白质通常局限于核糖体蛋白质。由于核糖体蛋白质在原核生物中是高度保守的(conserved)，因此，MALDI-TOF对紧密相关的微生物的区分是有限的。而且，株型鉴定(strain identification)和/或血清型鉴定、抗生素耐受性、抗生素敏感性、毒力(virulence)或其它重要特征的确定取决于蛋白质标记物而不是核糖体蛋白质的检测，其进一步限制了MALDI-TOF在微生物分析中的应用。采用MALDI-TOLF鉴定微生物的实验室必须采用其它方法以进一步表征被鉴定的微生物。另外，MALDI-TOF法对质谱形状匹配的依赖要求纯的培养物，以获得高质量结果，其通常不适用于直接测试含有不同微生物的样品。

已经采用了若干其它的质谱分析法以检测微生物。例如，已经描述了基于质谱的蛋白质测序方法，其中液相色谱与串联质谱联用(LC-MS/MS)，从源自微生物样品的蛋白质的酶分解物获得序列信息。该方法，称为“由下至上(bottom-up)”的蛋白质组学是被广泛应用的蛋白质鉴定方法。该方法可以提供亚种或株型级的鉴定，这是因为，色谱分离允许对核糖体蛋白质之外的其它蛋白质进行检测，包括有利于对抗生素耐受性标记物和毒力因子进行表征的蛋白质。所述由下至上的方法的主要缺陷是获得结果的时间延长，这是因为，需要对蛋白质进行分解、长时间的色谱分离和数据处理。因此，该方法不适用于高产出量处理。

发明内容

本发明包括一种用于在从培养物分离之后或者直接从样品对微生物进行鉴定的新方法和系统，其中所述方法和系统是基于通过高分辨率/质量准确性的单级(MS)或多级(MSⁿ)质谱来对微生物的蛋白质进行表征。本公开采用基本适用于几乎所有微生物的方法和高分辨率/质量准确的单级(MS)或多级(MSⁿ)质谱，还讨论了对毒力因子、抗生素耐受性标记物、抗生素敏感性标记物或其它特征的目标检测和评估。尽管以下讨论集中于通过蛋白质表征来鉴定微生物，但是本公开所述的方法和系统同等适用于通过对一种或多种小分子、脂类或碳水化合物等的表征来鉴定微生物。