[发明专利]生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(HANA)的方法

说明书

说明书摘要

公开的是用于生产透明质酸钠(HANa)的方法，其包括在合适的条件下，在含有糖作为碳源的营养培养基中培养马链球菌属(Streptococcus equi)兽疫(zooepidemicus)亚种的微生物。

本发明涉及通过链球菌属(Streptococcus)的微生物的大规模发酵来生产高度纯化的透明质酸钠盐的方法。

发明领域

本发明涉及用于生产高度纯化的透明质酸钠的方法，并特别涉及包括发酵步骤的方法。

通过本发明的方法，按照当前的纯度、安全性和一致性标准生产HANa。为了获得高的纯度，在方法中使用不含有动物来源成分的培养基。

由于其颗粒的多孔性和小的尺寸，通过本文要求保护的方法获得的HANa比动物和发酵来源的其他HANa溶解地更快，导致制造时间和成本的极大降低。此外，材料的高纯度使得其能够随后被灭菌，而分子量没有任何明显丢失。这种新的制造方法的优势因而是绝对的安全性、高纯度谱和低热不稳定性；快速的容散性和简单的过滤性以制备溶液；和分子量的重复性，其与低多分散性(polydispersity)相关。

现有技术

透明质酸是自然界中存在的糖胺聚糖，其由具有50,000-13,000,000道尔顿分子量的线性聚合物组成。其是通过交替的β1-3和β1-4键键合的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的重复单元形成的多糖。透明质酸存在于动物的多种结缔组织中，如皮肤和软骨。一些器官，如脐带、滑膜液、玻璃体液和公鸡冠中特别富含透明质酸。透明质酸还由多种微生物，如类型A和C的链球菌产生。透明质酸存在于所有的身体组织中，并执行许多重要的功能。其促进营养物的释放并从没有血液供应的细胞，如定位在软骨中的那些细胞中转运毒素；没有足量的HA的话，关节会恶化并且变脆。透明质酸不仅保持关节润滑，还刺激其他身体组织中的液体潴留。在皮肤和软骨中，透明质酸的作用是结合水并保持组织的张力和弹性。关节液中的粘性透明质酸溶液充当润滑剂，为细胞提供保护环境。

由于其亲水的性质及其流变学和润滑的性质，透明质酸钠是具有高增值的生物聚合物，其具有广泛的医学应用，包括皮肤水合、骨关节炎治疗、眼科手术、在腹部外科手术后防止粘连，和创伤愈合。

透明质酸钠的新用途是基于其修改细胞行为能力的药物释放、包被/移植和治疗处理。因为在许多所述应用中配制的产物的性能依赖于生物聚合物的分子量，所以MW代表透明质酸钠生产中头等重要性的特征。

具有两种获得透明质酸钠的主要方法：(i)从动物组织中提取透明质酸(例如从公鸡冠中提取)；(ii)培养微生物并回收作为发酵产物的透明质酸。

(i)从公鸡冠中提取昂贵且耗时，并且导致严重的问题，即由于降解透明质酸的酶(HAase)的污染而导致质量下降，和注射时的炎症反应。提取方法的特征还在于许多问题和低产量、初始材料的受限可用性、不能控制终产物的特征(如分子量)，和来自病毒的污染风险。

(ii)通过发酵合适的微生物生产透明质酸钠在成本方面代表有效的方法。在文献中描述了许多方法使用发酵技术生产和纯化透明质酸钠。然而，它们中的许多方法通常使用季铵盐来去除杂质，导致漫长的沉淀再溶解时间并且在终产物中存在季铵盐。此外，所述纯化技术主要基于不同的沉淀步骤，其需要广泛使用有机溶剂，因此增加了纯化产物和处理废物相关的成本。

US2010/0137579A1公开了用于纯化生物来源(兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus))的透明质酸的方法，其适合用于医学使用，包括渗滤和超滤步骤。

出版物Biopolymers,2010,387-412描述了这样的方法，其用于通过发酵Streptococcus zooepidermicus，通过碳滤池过滤、超滤/渗滤和通过微量过滤灭菌来生物技术生产透明质酸。

Separation and Purification Technology,2006,52,29-38描述了两步切向流过滤方法，其用于从发酵液中分离透明质酸。然而，该方法不适合于大规模生产透明质酸，并且后者不能达到适合于医学使用的纯度。

在所述方法相关的问题上，简单、容易应用并且能够去除杂质如蛋白质、核酸、内毒素、金属离子等的透明质酸钠制造方法的重要性是清晰的。

发明描述

本发明涉及高产量生产透明质酸钠的方法，该方法通过在好氧条件下，在富含气流的生长培养基中发酵链球菌细菌，随后从所得培养液中分离细菌，并从该培养液中分离透明质酸钠。