[发明专利]核酸复合物及核酸多糖复合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高包含DNA与RNA的核酸复合物的血清中稳定性的技术。

背景技术

人类基因组的解读，已经在距离发现DNA双螺旋结构的1953年之后的第50年、即2003年完成。目前，正在进行阐明各种蛋白质的活性机理以及蛋白质间的相互作用。并且最近逐渐了解到，不编码蛋白质的RNA控制着基因的转录、翻译。作为应用这样的成果的方法之一，提出了使用具有生理活性的短人工核酸(核酸药物)操控生物体功能的技术。

小干扰RNA(small interfering RNA，即siRNA)是由21～23个碱基对构成的低分子双链RNA。siRNA参与被称为RNA干扰(RNAi)的现象(参照非专利文献1)、序列特异性地阻遏信使RNA(mRNA)，抑制蛋白质表达。通常认为，该现象是生物体作为应对病毒感染等的防御机制的一环节而逐渐进化形成的。由于仅基于基因序列信息就能够设计出，因此不需要如此前的低分子药物那样的大规模筛选，此外，由于能够特异性地阻遏特定基因，因此认为副作用小，预期将成为新一代治疗药。

但是，作为天然型核酸的磷酸酯型RNA，在生物体内由于核酸酶、与蛋白质的非特异性吸附会在极短时间内失活。因此，天然型核酸药品在人类临床研究中并未带来有意义的效果。为了解决天然型核酸这样的在生物体环境内和培养液中短时间内失活的问题，提出了多种对天然型核酸进行化学修饰而成的化学修饰核酸。尤其已知的是：例如将核糖的2’-位的羟基用甲氧基(2’-O-甲基)(参照非专利文献2)、氟(F)(参照非专利文献3)、锁式核酸(locked nucleic acid)(LNA)(参照非专利文献4)进行化学修饰而得到的化学修饰核酸。此外，还报道了这样的化学修饰使得siRNA与靶mRNA的结合亲和性提高。

将这样的化学修饰核酸称为核酸类似物。核酸类似物与天然型核酸相比成功地大幅度延长了失活时间。这是由于核酸酶无法识别核酸类似物。但是，产生了在生物体内与蛋白质发生非特异性吸附、无法预期的生理活性、引起重度肝损伤等由非天然所带来的毒性问题。

还提出了如下技术：将天然型核酸包封至具有生物体适合性的化合物中，保护核酸不被分解，并且改善膜透过性从而将核酸导入细胞内。逆转录病毒(参照非专利文献5)或腺病毒(参照非专利文献6)等虽然已经获知作为基因载体在体外是极有前途的，但是这些天然来源的病毒的炎症性、免疫原性、以及诱导突变及重组到细胞基因组中风险性也备受指摘，这些使其在体内的使用受到限制。

因此，提出了一种作为天然来源的基因载体的代替物的、不仅操作比病毒系统简单而且能够使DNA切实向细胞高效率集中的、人工材料作为非病毒载体的用途(参照非专利文献7)。迄今为止，作为非病毒性的人工核酸载体，已经开发出聚乙二醇修饰的多聚阳离子(参照非专利文献8)、聚乙烯亚胺(参照非专利文献9)、阳离子性聚合物的嵌段共聚物(参照非专利文献10)、树枝状高分子(参照非专利文献11)等。但是，这样的阳离子性高分子的安全性尚未确认。为了具有阳离子性，氨基的存在是必不可少的，但是氨基的生理活性高，存在体内毒性等风险。

本发明人着眼于此前作为基因载体的β-1,3-葡聚糖，已经发现了β-1,3-葡聚糖与核酸药物(反义DNA、CpG DNA)形成新型的复合物的现象(参照专利文献1、2，非专利文献12、13、14)。

我们发现，将天然以3螺旋存在的β-1,3-葡聚糖溶解于二甲基亚砜(DMSO)等非质子性极性有机溶剂、或0.1N以上的碱溶液使其解离为单链后，加入单链的核酸，使溶剂变为水或恢复至中性，由此形成了由1分子核酸与2分子多糖构成的3螺旋复合物。我们认为，此时，3螺旋复合物中的多糖分子与核酸分子主要是通过氢键与疏水性相互作用而形成分子间结合的(参照非专利文献15)。

如上所述，已经报道了与β-1,3-葡聚糖复合化的核酸为单链核酸，尤其聚脱氧腺嘌呤(poly dA)、聚胞嘧啶(poly C)与以西佐喃(sizofiran，SPG)为首的β-1,3-葡聚糖显示出强亲和性。

对于以β-1,3-葡聚糖作为siRNA的载体应用于RNAi也进行了研究。但是，siRNA为双链核酸，因此不能直接与β-1,3-葡聚糖形成复合物。因此，为了与SPG等β-1,3-葡聚糖复合化，准备了对siRNA的正义链附加poly(dA)而成的DNA-RNA杂化核酸，使其与siRNA的反义链退火，从而制作了poly(dA)-siRNA。然后，利用poly(dA)部分与SPG进行复合化。

现有技术文献

专利文献