[发明专利]使用丝状真菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法

说明书

一种多核苷酸，其是在至少一个密码子中具有与编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽的野生型碱基序列不同的碱基序列且被修饰的多核苷酸，修饰的密码子的使用频率为腐质霉、曲霉及木霉3种丝状菌的密码子使用频率，在丝状菌中能够使编码的多肽表达。

技术领域

本发明涉及一种使用丝状真菌的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法。更详细地涉及：编码来自西洋山葵的过氧化物酶多肽并在该丝状真菌中能够表达该多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、将该表达载体导入丝状真菌而形成的转化体、使用该转化体的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质的制造方法、以该制造方法制造的来自西洋山葵的过氧化物酶重组蛋白质及含有其的制剂以及其用途。

背景技术

来自西洋山葵的过氧化物酶作为在酶联免疫测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay；ELISA)、免疫组织染色法、南方墨点法、西方墨点法等各种试验中检测用的酶的一种，被广泛使用。此外，近年来也被广泛用作临床检测试剂盒用酶。

虽然过氧化物酶广泛存在于萝卜、红薯、小麦、日本山葵、西洋山葵等一般植物界中，但是由于西洋山葵的过氧化物酶含量较高等理由，在工业生产上，优选用西洋山葵。

但是，来自西洋山葵的过氧化物酶由酸性、中性及碱性同工酶等多种酶构成。另外，过氧化物酶含量及这些同工酶组成比除了根据栽培土壤的性质、给予肥料的种类以及量、气候、收获时间等不同会有显著的变动以外，由于是以破坏植物并从多种多样的夹杂成分中纯化过氧化物酶的方法来制造，因此从西洋山葵纯化的过氧化物酶的品质并不一定是恒定的。也就是，现在广泛使用的来自西洋山葵的过氧化物酶制品的大多数几乎是多种同工酶的混合物的状态，其比例几乎每个批次不同。进行使用这种来自西洋山葵的过氧化物酶制品的各种测定，例如ELISA时，随制造批次而产生不均匀，因而存在难以得到稳定的测定结果的重大问题。

此外，由于作为原料的西洋山葵的栽培需要长时间，根据气候不同其产量会变动，近年来，由于栽培效率的恶劣或轮栽成需要量大的生物乙醇用谷物等理由，担忧会产生西洋山葵的供给不稳定的状况，对于能够稳定供给的来自西洋山葵的过氧化物酶的潜在的需要大。

作为克服具有如前述所示的来自西洋山葵的过氧化物酶的问题的方法，考虑通过使用基因重组技术的微生物来大量生产。通过使用微生物，不仅能够在短时间内大量栽培，也能够不受气候等影响而进行稳定供给。此外，利用基因重组技术，能够大量地仅表达作为目的的过氧化物酶，因此也能够避免同工酶的夹杂的问题。

在来自西洋山葵的过氧化物酶中，作为主要同工酶之一的过氧化物酶C1a，其DNA序列及氨基酸序列已明确(参照非专利文献1)。此外，研究使用编码过氧化物酶C1a的基因在大肠杆菌、酵母及烟草植物细胞中的表达。但是，其表达量在大肠杆菌中的0.11mg/L(参照非专利文献2)、在酵母中的5.3mg/L(参照非专利文献3)、在烟草植物细胞中的3mg/L(参照非专利文献4)为微量，生产极低且不实用。由以上所述，期望开发可大量生产来自西洋山葵的过氧化物酶的重组生物以及使用它的来自西洋山葵的过氧化物酶的制造方法。

现有技术文献：

非专利文献

非专利文献1:Fujiyama et al.Eur.J.Biochem,1988年，173卷，第681-687页

非专利文献2：Lin et al.Biotechnol.Prog.,1999年，15卷，第467-471页

非专利文献3：Morawski et al.Protein Engineering,2000年，13卷，第377-384页

非专利文献4：Matsui et al.J.Biosci.Bioeng.,2006年，102卷，第102-109页

发明内容

发明要解决的课题