[发明专利]流感疫苗构建体

说明书

联邦政府资助的研究和开发

本发明受政府支持在美国国立卫生研究院授予的批准号A1057229下进行。政府具有本发明的某些权利。

发明背景

流感是全球公共卫生重大挑战。虽然有几种不同的流感疫苗和药物可用于预防和治疗流感，但是单在美国每年就有2500-5000万个流感案例和30,000-40,000人死亡。由于病毒传播迅速、潜伏期短且病毒糖蛋白的抗原性变化，控制季节性A型流感病毒是一种挑战。

A型流感病毒是正粘病毒(Orthomyxoviridae)家族的反义、单链、分段RNA病毒。存在几种亚型，根据H编号(对于血凝素类型而言)和N编号(对于神经氨酸酶类型而言)标记。存在16种不同的H抗原(H1至H16)和9种不同的N抗原(N1至N9)。每种病毒亚型已经突变成多个具有不同致病性的菌株；一些对一个物种有致病性，但是对其它物种没有，一些对多个物种均有致病性。

当两个或更多个菌株感染同一细胞时，A型流感基因组分段利于在菌株间重排。重排可产生称为抗原转移的重大基因变化。相反，抗原漂移是具有较小基因变化，主要是HA和NA蛋白质中的氨基酸取代的病毒菌株的积累。通过病毒编码的RNA依赖型RNA聚合酶复合物的A型流感核酸复制相对易错，并且RNA基因组中的这些点突变是抗原漂移基因变异的主要来源。选择倾向于抗原漂移和转移牵涉HA和NA蛋白质的人A型流感菌株，因为这些菌株之后能够躲避来自预先感染或接种的中和抗体。在二十世纪，抗原转移引起3大A型流感大流行，而抗原漂移是每年流感流行的原因。

血凝素A牵涉于向宿主细胞糖蛋白和糖脂上末端唾液酸残基的病毒附着。病毒进入细胞的内体隔室后，HA还牵涉与细胞膜的融合。HA作为在病毒表面形成非共价键合同型三聚体，通过宿主蛋白酶裂解以产生通过一个二硫键缔合的两个亚基的HA₀前体合成。成熟HA形成具有由源自HA2结构域的α螺旋三链卷曲螺旋和源自HA1结构域的球状头部构成的长纤维茎部的同型三聚体。

为有效预防流感感染而提供并且针对快速进化病毒的疫苗引起极大医学兴趣。本发明解决了这一问题。

相关文献

其中，关于折叠子在流感疫苗构建中的用途的出版物包括US 2009/0208531。例如，在US 2012/0014972和US 2010/0297174中可找到关于HA茎部在流感疫苗构建中的用途的出版物，其各自以引用的方式特别并入本文。

在专利公布US 2010-0093024A1中描述了在CFPS期间引入非天然氨基酸的方法。在专利申请US-2010-0168402-A1中描述了通过非天然氨基酸将抗原和其它多肽直接连接到病毒样颗粒的方法。在专利公布US-2010-0167981-A1中描述了将货物包裹于通过CFPS生成的病毒样颗粒中的方法。那些文件的每一个均以引用的方式特别并入本文。

发明概述

提供了包含三聚流感血凝素(HA)茎部抗原的疫苗组合物。通过用极性氨基酸取代一个或多个疏水性氨基酸残基，特别是用极性氨基酸取代暴露结构域中的疏水性残基，由野生型修饰HA抗原的序列。通过去除茎部中含疏水性残基和半胱氨酸的多肽区域进一步修饰所述序列。经修饰HA抗原与三聚化结构域融合，包括但不限于T4噬菌体纤维蛋白折叠子。在一些实施方案中，修饰所述序列以允许将用于连接抗原的非天然氨基酸引入病毒样颗粒(VLP)，其中限定的非天然氨基酸可位于三聚化结构域的末端，或在HA茎部螺旋结构外侧。在另外的实施方案中，修饰所述序列以包括用于蛋白质纯化的基序，例如组氨酸标签、蛋白酶裂解位点等。

可通过用编码融合蛋白的核酸转化宿主细胞，培养宿主细胞并且从培养物中回收融合蛋白，或可选地通过生成编码所述融合蛋白的核酸构建体并且通过无细胞合成生成多肽，制备本发明的融合蛋白，所述合成可包括偶联转录和翻译反应。还提供了载体和编码所述融合蛋白的多核苷酸。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于本发明融合蛋白的无细胞蛋白质合成(CFPS)的方法。在一些实施方案中，在配制之前从反应混合物分离出CFPS产物并且重折叠。在一些实施方案中，在洗涤剂，通常为非离子型洗涤剂的存在下进行重折叠。所述洗涤剂可以约0.01至0.1％，通常为0.05％左右的浓度存在。目标洗涤剂包括非离子型聚氧乙烯表面活性剂，例如Brij 35、吐温20(Tween 20)等。