[发明专利]重组系统

权利要求书

1.在靶位点进行重组以添加新的序列、置换现存的序列和/或缺失现存的序列的方法，该方法包括：

-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别所述位点特异性重组位点的重组酶的序列，其中所述两种或更多种核酸都不包含(a)、(b)和(c)中所描述的全部序列，

其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，其中所述核酸的末端被设计为使得所述核酸以期望的方向和顺序被组装以产生所述单一核酸，并且

其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列；以及

-将所述两种或更多种核酸引入宿主细胞以使重组到所述宿主细胞能够发生，以及

-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能重组酶的连续核酸序列和至少两个位点特异性重组位点，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列，其中核酸的相互重组以及与靶位点侧翼序列的重组在真菌细胞体内进行；其中：所述位点特异性重组位点是lox位点并且所述重组酶是Cre；所述位点特异性重组位点是FRT位点并且所述重组酶是Flp；所述重组位点是Vlox位点并且所述重组酶是VCre；或所述重组位点是Slox并且所述重组酶是SCre。

2.根据权利要求1的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列，以使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点侧翼序列重组，导致在每个靶位点插入至少两个位点特异性重组位点，其中：

编码有功能重组酶的连续核酸序列存在于位置在至少两个位点特异性重组位点之间的至少一个靶位点，以及

所述位点特异性重组位点的侧翼为能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列。

3.根据权利要求1或2的方法，其中至少两种核酸中的两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列，以使它们总共包含编码有功能的重组酶的核酸序列。

4.根据权利要求1的方法，其包括表达重组酶以使位置在所述位点特异性重组位点之间的序列被外重组。

5.根据权利要求4的方法，其中所述重组酶的表达受诱导型启动子的控制。

6.根据权利要求1的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列，以使两种或更多种核酸的重组导致在靶位点或多个靶位点插入所述标记基因编码序列，从而其位于至少两个能够与靶位点或多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。

7.根据权利要求2的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含两种或更多种不同的编码标记的序列，以使所述两种或更多种核酸的重组导致在各靶位点插入不同的标记基因编码序列。

8.根据权利要求6的方法，其中所述两种或更多种核酸的重组导致在靶位点插入所述编码标记的序列，从而其位置在位点特异性重组位点之间并且能够通过重组酶的表达从靶位点被外重组。

9.根据权利要求4的方法，其中位点特异性重组位点之间的核酸序列的外重组在体内进行。

10.根据权利要求1的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

11.根据权利要求1的方法，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。

12.根据权利要求4的方法，其中所述位点特异性重组位点使得重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被所述重组酶识别的单一突变位点特异性重组位点。

13.根据权利要求1的方法，其中所述靶位点包含被破坏和/或部分或完全缺失的编码序列。