[发明专利]由人多能干细胞衍生内皮细胞

说明书

发明领域

本发明总体上涉及干细胞，并且更具体地说涉及由人多能干细胞衍生内中胚层前体细胞和内皮细胞的方法。

背景信息

人胚胎干细胞(ES)细胞为可分化成一大系列细胞类型的多能细胞。干细胞因两项重要特性而与其它细胞类型不同。首先，它们是能够通过细胞分裂、有时是在长期失活之后更新本身的非特化细胞。第二，在某些生理或实验条件下，它们可被诱导变成具有特殊功能的组织-或器官-特异性细胞。在如肠和骨髓的一些器官中，干细胞有规律地分裂以修复并更换磨损或损坏的组织。然而，在如胰腺和心脏的其它器官中，干细胞仅在特殊条件下分裂。

在胚胎发育期间，干细胞由三种主要细胞群体：外胚层、中胚层和定形内胚层形成身体组织。中胚层产生血细胞、内皮细胞、心肌和骨骼肌及脂肪细胞。定形内胚层产生肝、胰腺和肺。外胚层产生神经系统、皮肤和肾上腺组织。

干细胞的潜在应用是制造用于医学疗法的细胞和组织。现今，捐赠的器官和组织经常用于更换患病或破坏的那些器官和组织。遗憾的是，需要移植物的人数远远超过可用于移植的器官数。干细胞提供用以治疗包括帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌萎缩性侧索硬化、脊髓损伤、烧伤、心脏病、糖尿病和关节炎的多种疾病、病状和障碍的更换细胞和组织的可再生来源的可能性。

内皮为内衬血管和淋巴管的内表面、从而在内腔中的循环血液或淋巴液与管壁的剩余部分之间形成界面的细胞薄层。血管疾病是大型和中型肌动脉的病理状态且因内皮细胞功能障碍而触发。由于如病原体的因子，氧化的LDL粒子及其它炎性刺激内皮细胞被激活且开始分泌细胞因子和趋化因子并在它们的表面上表达粘附分子。所述过程最终导致管壁增厚，从而形成由增殖平滑肌细胞、巨噬细胞和各种类型的淋巴细胞组成的斑块。所述斑块导致血流受阻，从而导致到达靶器官的氧和营养素的量减少。在最终阶段，斑块还可能破裂，从而导致形成凝块，且结果导致中风。需要用于血管疾病的新型治疗。本文提供一种用于产生可适用于治疗血管疾病的内中胚层前体细胞和内皮细胞的高纯度群体的方法。

发明概述

本发明部分地基于一种由人多能干细胞(hPSC)产生内中胚层前体细胞(EMPC)和内皮细胞(EC)的化学上定义的方法。本发明还提供适用于由人多能干细胞衍生内中胚层前体细胞和内皮细胞的试剂和试剂盒。

本发明提供通过用至少一种内中胚层诱导化合物处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物测定所述细胞来产生内中胚层前体细胞(EMPC)。本发明还提供使用新近发展的化学定向分化方法经由可将细胞扩增并冷冻保存的内中胚层阶段以稳健且可再现的方式由hPSC衍生内皮细胞(EC)的高纯度群体、同质群体。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于产生内中胚层细胞(EMPC)的方法。所述方法包括用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021或其盐或类似物。其它拮抗剂包括3F8、A1070722、AR-A014418、BIO、FRATide、10Z-Hymenialdsine、靛红-3’-肟、坎帕罗酮(Kenpaullone)、L803、NSC693868、SB216763、SB415286、TC-G24、TCS202、TCS 21311和TWS119，全部经Glaxo Smith Kline购得。

一方面，所述hPSC为人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或诱导的多能干细胞(iPSC)或自其衍生的细胞系。

一方面，所述内中胚层前体细胞标记物包括例如MIXL1、NODAL和BRACHYURY或其任意组合。

在一个实施方案中，本发明提供内中胚层前体细胞(EMPC)。所述受试EMPC通过用糖原合成酶激酶3(GSK-3)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)并且针对内中胚层细胞标记物分析所述细胞来产生。一方面，将hPSC用GSK-3抑制剂处理约24小时或12-36小时。另一方面，GSK-3抑制剂为Chir99021且内中胚层标记物为Brachyury。