[发明专利]制备生理活性多肽复合物的改进方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备复合物的方法，该复合物中的生理活性多肽通过含两个或更多个醛作为官能团的非肽基聚合物连接体共价结合至免疫球蛋白恒定区。更具体地，本发明涉及有效制备生理活性多肽复合物的方法，其特征在于通过在制备时调整还原剂的使用来改进低产率和多肽试剂变形的问题。

背景技术

总体而言，生理活性多肽由于它们的低稳定性而容易变性，并且在血液中容易经历蛋白水解降解和随后的肾或肝脏清除。因此，含生理活性多肽作为药物成分的蛋白质药物需要频繁地对患者给药，以维持适当的血清水平和效价。然而，此类蛋白质药物的频繁给药(其大多数是以注射的形式)引起患者疼痛而且治疗成本高。为了解决这些问题，已经投入许多努力来改进蛋白质药物的血清稳定性，和使血液中的药物长期维持在高水平以使药物的药效达到最大。作为长效制剂使用的需求，蛋白质药物必须配制成具有高稳定性并且维持足够高水平的效价而不引发患者的免疫应答。

传统的稳定蛋白质和防止酶降解及肾脏清除的方法是用具有高溶解度的聚合物(例如，聚乙二醇(在下文中称为“PEG”)对蛋白质药物的表面进行化学修饰。通过结合至目标蛋白的特定区域或各种区域，PEG使得蛋白质的溶解度更高，从而稳定蛋白质并防止水解而不引起严重的副作用(Sada等人，J.发酵生物工程(J.Fermentation Bioengineering)71:137-139)。

例如，WO 2006/076471公开了通过将B-型钠尿肽(BNP)与PEGs结合而使其长效的方法，该PEGs结合至钠尿肽受体A(NPR-A)以引发cGMP的合成，从而降低动脉血压。其因而用于充血性心力衰竭的治疗。美国专利号6,924,264描述了一种通过使其赖氨酸残基PEG化来改进艾塞那肽(exendin-4)在体内的持续时间的方法。然而，在此方法中，尽管其有能力通过增加PEG的分子量来增加肽药物的循环时间，但PEG化仍有问题，例如，大大降低了肽药物的效价和降低了产率，这是因为随着PEG的分子量增加，肽的反应性下降。

WO 02/46227公开了这样的融合蛋白，其中GLP-1和艾塞那肽(exendin-4)或其类似物与人血清白蛋白或通过遗传重组制备的免疫球蛋白片段(Fc)结合。美国专利号6,756,480涉及这样的融合蛋白，其中甲状旁腺激素(PTH)或其类似物连接至Fc。虽然这些方法可被评估为PEG化问题——例如低产率和非特异性——的解决方案，但是已经显示其增加目标肽的体内半衰期的效果不显著，与预期相反，而且在某些情况下，融合蛋白具有低效价。虽然多种肽基连接体被利用以使增加血清半衰期的效果达到最大，但它们有可能引起免疫应答。此外，具有二硫键的肽(例如，BNP)在实际应用中有困难，因为其很容易引起错误折叠。此外，不可能通过遗传重组产生具有非天然氨基酸残基的肽基连接体。

胰岛素是由人胰腺β-细胞分泌的肽，主要是调节体内血糖水平。当胰岛素分泌不正常或分泌的胰岛素无法在体内适当地发挥作用时，血糖水平不能被控制并且升高，导致糖尿病。后一种情况称为2型糖尿病。然而，在胰岛素不能从胰腺分泌并且引起血糖水平升高的情况下，导致1型糖尿病。2型糖尿病患者用口服降血糖剂治疗，其中一些患者用胰岛素治疗。同时，对于1型糖尿病患者基本上需要注射胰岛素。

通常，通过在每餐之前或之后每天注射三次来施用胰岛素进行胰岛素疗法。然而，每天三次连续胰岛素给药对于患者是痛苦的而且不方便。已经做出很多尝试来解决这些问题。旨在提高蛋白质药物在生物膜中的通透性的一种策略是通过口或鼻吸入来递送药物。然而，与注射相比，通过口或鼻吸入给药的递送效率明显地低，并且难以将肽药物维持在体内活性所需的水平。

作为可供选择的策略，可以将过量药物皮下注射并以延迟的方式吸收至体内，以维持恒定的血液水平，即使每天注射一次。一些药物(例如，兰德仕(Lantus))、赛诺菲安万特(Sanofi-aventis))已被批准用于商业用途并且目前已对患者给药。另外，已经针对用脂肪酸修饰胰岛素进行了研究以使胰岛素结合物的结合更强并通过在注射位置或血液中与白蛋白组合来延长持续时间。一些药物(例如，诺和平(Levemir)、诺和诺德(NovoNordisk))已被批准用于商业用途。然而，这些药物在注射位置引起疼痛并且必须每天注射一次，这对患者仍是巨大的负担。