[发明专利]从阳性血培养中隔离活性微生物的流程与配方

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求美国临时专利申请号为61/604732，2012年2月29日提交的专利申请于申请之日的权益，其公开内容在此通过引用的方式并入。

相关专利申请

本专利申请的标的涉及美国专利号为13/647,072，2012年10月8日提交的美国专利申请，该专利申请要求美国临时专利申请号为61/544,407，2011年10月7日提交的专利申请于申请之日的权益，其公开内容在此通过引用的方式并入。

发明背景

败血症是一种严重的疾病，是由宿主的免疫系统对感染的过激反应所引起的。它可以引发全身性炎症，导致血流量受损。随着败血症的病程发展，会因为身体器官极度缺乏氧气和营养物质而造成永久性损伤，并最终导致器官衰竭。如果诊断不当或不进行治疗，心脏会变得衰弱并可能发生感染性休克，导致多个器官衰竭而死亡。为了检测败血症患者的血液中是否存在细菌或酵母菌，必须进行血培养。如果存在微生物(血培养阳性(PBC))，则必须鉴定出这些微生物并确定其对抗生素的敏感性，以提供适当的治疗。血培养阳性的血样用于隔离、鉴定和进行抗生素敏感性试验(AST)。微生物鉴定的常用方法有质谱法，包括MALDI-TOF/MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)或基于表型生长的方法，如Phoenix^TMID。

为了鉴定出微生物，在对微生物进行表型分析和AST检测时，需要从采集的血样中的血细胞或其他物质中隔离出完整、有活性的微生物。在通过质谱法鉴定微生物时，微生物样本中应完全不含已知会干扰MALDI-TOF/MS鉴定的物质，如血细胞成分、其他细胞碎片和盐等。此外，微生物样本的量必须足够，这样才能得到可靠的鉴定。表型鉴定法，如Phoenix^TM ID等需要完整而有活性的微生物，不含可能对分析所用的酶底物产生干扰的物质。在进行AST检测，如Phoenix^TM AST检测时，微生物样本中需含有能在分析的过程中，在有耐药性且抗生素存在的情况下生长，有活性，且没有发生改变的微生物。对所有方法而言，重要的是量必须充足，纯度必须足够，因为样本中如携带残留的血液或培养基成分，就会对试验造成直接干扰，或因微生物浓度(浊度)的误导性偏大而间接造成干扰。

按照目前的技术，从PBC样本中隔离出活微生物需要进行微生物传代培养，这一过程需要的时间长达72小时。这就会造成治疗的延迟或采用不正确的抗生素治疗。

微生物中的某些菌株尤其难以在保持生物体活性的情况下从PBC样本中隔离，例如肺炎链球菌(S.pneumoniae)。之所以难以隔离，部分原因是肺炎链球菌能激活自溶素(autolysin)，从而使这种微生物的细胞发生“自毁”。请参见《用阳性血培养瓶的肺炎链球菌抗原检测法作为替代方法诊断肺炎球菌菌血症》(Streptococcus pneumoniae Antigen Test Using Positive Blood Culture Bottles as an Alternative Method To Diagnose Pneumococcal Bacteremia，Journal of Clinical Microbiology,Vol.43,No.5,May 2005,p.2510-2512.)一文。目前从败血症患者体内隔离微生物，包括肺炎球菌的方法需要用血培养瓶进行接种。在得到阳性信号后，一部分PBC样本被取出进行革兰氏染色，另一部分用于微生物传代培养。传代培养出的微生物菌落用来进行下游的检测，如通过MALDI-TOF/MS进行鉴定，表型鉴定法和AST检测等。

从PBC样本中隔离活性微生物的其他技术通常要采用液体分离法，液体中含有裂解缓冲液和可使PBC样本中的血细胞裂解的清洗剂。在裂解后，可将裂解的血细胞清除而保留微生物。然而，使用这些裂解缓冲液往往会影响、破坏微生物或使其失去活性，造成其数量不足，无法满足某些基于生长的鉴定方法，如AST检测的要求。