[发明专利]用于任何聚合酶延伸活性的灵敏的，定量的聚合酶活性检测和用于确定活细胞的存在的方法

说明书

对相关专利的交叉引用

本申请为非-临时申请，通过引用并入并要求申请日为2012年04月12日，美国临时申请61/623,114的优先权。

发明背景技术

本部分和全文用到的参考文献编号是指列于“参考文献”部分的那些文献。

DNA聚合酶活性对于基因组复制和生物体在所有生物区传播是不可缺少的^(1-3)。原核生物包含5种不同类型的DNA聚合酶，但哺乳动物细胞包含15种明显不同的细胞DNA聚合酶，但其中仅仅只有4种致力于DNA复制，而其他的则致力于DNA修复和特异的DNA合成工序，这些都实质上有助于基因完整性的保持。尽管这些酶的大部分涉及细胞核的DNA修复和复制，但发现于线粒体的DNA聚合酶γ(Polg)仅保持DNA聚合酶活性(Hum.Mol.Genet.(1July2005)14(13):1775-1783)。由于它的这种最初的特性⁽⁴⁾，体外治理DNA聚合酶活性的能力，使得它成为了分子生物学研究领域的基本工具⁽⁵⁾。超出它在研究中业已建立的重要性，体外DNA聚合酶活性测量可能在制药和临床事件中提供大量的有益的应用。例如，由于细菌的DNA聚合酶正在积极用于新型抗微生物剂的开发^(6，7)，能够快速和灵敏的测定DNA聚合酶活性的分析方法是必要的。此外，丧失或获得DNA聚合酶活性与人类疾病密切相关。例如，DNA聚合酶活性和遗传畸变之间出现的关联表明该酶是作为抗癌疗法的靶标^(8,9)。DNA聚合酶活性的缺陷也和线粒体疾病关联⁽¹⁰⁾。另外，DNA聚合酶活性的测定有可能作为快速和灵敏的诊断工具，在无菌的给定环境或生物基质中能够检测几乎任何携带活性DNA聚合酶的生物体。

用于体外测量DNA聚合酶活性最常见的方法取决于放射性标记的核苷酸的掺入⁽¹¹⁾。然而，由于这种方法的固有风险以及放射性同位素相关联的限制，使得常规使用这种DNA聚合酶测定是不受欢迎的。因此，在过去的几十年中开发了许多非放射性体外聚合酶检测方法。有些方法依赖于DNA聚合酶介导的单链结合蛋白⁽¹²⁾或PicoGreen^TM结合于双链DNA^(13,14)释放产生的荧光的测量。其他方法依赖于微板耦合及荧光标记的核苷酸检测⁽¹⁵⁾。最近，基于分子标灯⁽¹⁶⁾和电化学的⁽¹⁷⁾DNA聚合酶测定法得到了发展。尽管成功地避免使用放射性的，但上述方法由于差的灵敏度，小的测定线性动态范围，或者使用纯化聚合酶而受限制。在过去的五十年，聚合酶活性的体外测定已成为一个重要的分子生物学工具。由于放射性核苷酸的使用，用于体外测量聚合酶活性的传统的方法并不理想。已开发基于荧光的聚合酶分析方法，然而，它们也遭受各种限制。

发明概述

按照本发明，上述方法的各种限制已经寻找到解决方案，并且提供具有快速，高灵敏度和定量测定方法，能够测量来自纯化的聚合酶或直接从粗细胞裂解物，或亚细胞器的聚合酶延伸活性。当用纯化的DNA聚合酶进行测试时，该试验检测小至2x10^-11U的酶(≈50分子)，同时展现出优异的线性度(R²＝0.992)。低至至少10cfu加入革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌耦合到珠磨机裂解时，也能够检测到内源性DNA聚合酶延伸活性，同时保持R²＝0.999。另外，按照本发明，已经证明，DNA聚合酶延伸活性是细胞生存力的指标，这也由细胞信号与活细胞计数之间可重复的强烈一致所证实。类似地，通过选择性样本细胞制备，完整的哺乳动物细胞也可以通过DNA聚合酶延伸分析方法来进行定量和生存力评估。总之，在给定的样本基质中，在此描述的本发明的新方法对包含活性聚合酶的任何可能细胞或亚细胞器的灵敏的检测表现出显著改进。

本发明的发明人对涉及酶的模板生成和扩增(ETGA)方法具有持续的兴趣。例如，美国专利申请序列号13/641480，申请日为2012年10月16日和共同转让的提交，描述了一种涉及这种ETGA方法及其用途的新技术。所述美国序列号为13/641480的这种ETGA方法的技术范围在此并不作明确描述，但在此描述和要求保护的发明的完全公开可能是必要的，上述美国专利申请的全部公开内容通过引入并入本说明书。