[发明专利]电阻抗法细菌检测系统

说明书

相关申请对照参考

本申请要求2012年2月15日提交的第61/599,100号美国临时专利申请提交日的优先权，这里将其公开内容引为参考文献。

发明背景

该发明涉及临床样本中的微生物检测领域，尤其涉及对生物样本中是否含有细菌实施快速检测。

检测生物样本中是否含有微生物，如细菌，对于人体健康很有必要。一般此类检测需要培养出足够的微生物时，才能进行检测。样本中微生物生长需要多种培养基，只有当待测样本中有足够数量微生物时，才能保证微生物被检测到。

例如，通常在含30毫升供细菌繁殖的生长培养基的培养瓶中，加入约10ml的全血进行接种，用来检测临床血液样本是否染菌。培养瓶中的样本在35℃下自动进行培养，通过检测样本中细胞代谢和生长产生的副产物来测定样本中是否含有细菌。在一个实施例中，细菌代谢产物(如CO₂)可通过培养瓶中放置的化学传感器进行检测。

在总体积为80ml的培养瓶中，含有一个生长的细菌菌落时，通常需要微生物数量升至5×10⁹CFU(菌落形成单位)才能检测得到。很显然，10ml的血液样本中要达到如此高的数值，需要从1个或者2个微生物发生细菌倍增以产生细菌群落。一个实现快速细菌检出的方法是，将10ml样本溶液与所需生长培养基混合(通常30ml的生长培养基与10ml的血液样本混合)，然后分离成放于密闭的样本室中的大量小体积副样本。这种方法在Berndt的美国5770440号和5891739号专利中已有记述，这里将其引为参考文献。被本专利引用为文献的Monthony等人的美国5716798号专利中，阐述了一些小体积样本室(每孔体积为250μl的96孔板)彼此不紧连，但是有一个顶部连接空间。Monthony等人考虑使用比色法，荧光法，放射性测定，浊度法和红外分析法检测样本孔中是否染菌。Monthony等人报告称，采用较小样本体积可以缩短细菌检测时间(TTD)。

虽然将10ml血液原样与30ml生长培养基混合后分离，在实现快速细菌检测方面取得了成功。但是设计一个实际的多室样本容器用于检测1个或以上样本室中是否存在微生物则是一个难题。例如，如果仅在一个或两个小样本室中检测到细菌生长，则需要对这些样本室进行判定和样本提取，以便从这些样本室中移出染菌样本溶液。检测结果阳性的样本溶液的可以用于下游分析，如ID(如飞行时间质谱)和药物敏感试验(AST)。从样本组中分散的一些小样本室的分散室中准确移除样本又是一个难题。

对于检测微生物生长而使用小体积样本室的方法存在的另一个难题是，如何选择合适的检测器。单个样本室的光询问需要测定准确，以保证测量结果与适合的样本室紧密相关。要避免样本孔之间的信号交叉串扰。每个孔配置独立的化学传感器，则使得成本高而难以实施。

介电阻抗测试被认为是化学传感器应用的替代方法。然而，介电阻抗测试方法商业应用的障碍在于，阻抗对温度改变敏感。保持血液培养瓶温度超过+/-0.05℃对于获得理想的临床细菌检测环境仍不切实际。

Sengupta,S等人认为参考文献LabChip,第6卷，682-692页(2006年)中的“微尺度多频率电抗测定技术可以用于检测样本中低浓度生物颗粒中细菌的生长情况”，在这里引为参考文献。100μl容积的微流体样本室可以用于检测对细菌存在的响应。Sengupta等人称，相对于简单电介导电性测量而言，当使用长而极细的通道状含有液体样本的，并且两端配有极小电极的样本室时，可以提高检测响应。Sengupta等人称通过使用高达100MHz的频率时，可以检测液体样本的电容量，这对于由于细菌存在和/或生长引起的样本电容变化更加敏感。

Sengupta等人进一步表示“使用倍频微通道阻抗方法可以快速检测食品样本中的细菌增殖情况”Scns&Instrumen.FoodQual.,第四卷，108-118页(2010年)和Puttaswamy,S等人称，“新颖的电学测定方法可以用于血液培养基中的活性细菌的检测。”J.Chin.MicroBio.,49卷第6期，2286-2289页(2011年)。这里都加以引用为参考文献。对于使用Sengupta,S等人的介电电导率法方法检测样本中的细菌方法，温度波动是最大的难题。