[发明专利]治疗血红蛋白病的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请作为PCT国际专利申请于2013年2月22日提交，并要求2012年2月24日提交的美国临时专利申请No.61/603,231的优先权，其公开内容在此以全文引用的方式并入本文。

序列表

本申请包括作为txt文件的电子形式的序列表，其标题是“序列表54428.0006WOU1_ST25”并于2013年2月22日创建并且其大小为174千字节(KB)。所述txt文件“序列表54428.0006WOU1_ST25”的内容通过引用方式并入本文。

技术领域

本公开总体涉及遗传病的治疗。更具体地，本公开提供用于改变球蛋白基因表达的基于内切核酸酶的组合物和方法，包括基于归巢内切核酸酶和基于Cas9内切核酸酶的组合物和方法，所述组合物和方法用于治疗地中海贫血、镰状细胞病和其它血红蛋白病。

背景技术

血红蛋白病，诸如地中海贫血和镰状细胞病，是在全球导致显著健康负担的非常普遍的红细胞遗传病。每年有超过1,300,000名患有严重血红蛋白病症的患者出生。当全球人口的5％是携带者时，对于临床显著形式的地中海贫血和镰状细胞病(SCD)的出生率分别是0.44个/千人和1.96个/千人。

在正常状态下，哺乳动物红系细胞中存在的血红蛋白主要由两条α样链(多肽)和两条β样链的异源四聚体构成。所述β-球蛋白基因座的五个基因以簇的形式位于染色体11上。所述基因在红系细胞中表达，并且伴随发育在特异性位置进行；所述ε、Αγ和Gγ、及δ和β基因主要分别在胚胎期、胎儿期和产后期表达。出生时95％的β样链是γ，剩下的是β。这一比率在出生后第一年逐渐转变，这解释了为什么限于β-球蛋白基因的表型诸如镰状细胞和大多数β-地中海贫血直到数月大时才表现出来。基于染色体16的α样基因的表达不同；胚胎ζ-基因与ε的表达对应，但是成对的α-基因从胎儿期开始表达。因此，α异常在子宫内表现，潜在地伴有毁灭性的结果(如胎儿水肿)。所得的α-异源四聚体、β-异源四聚体伴随发育表达；胚胎：Hb Gower1(ζ2,ε2)、Hb Gower2(α2,ε2)和Hb Portland(ζ2,γ2)；胎儿：HbF(胎儿)(α2,γ2)以及成人：HbA2(α2,δ2)和HbA(成人)(α2,β2)。

β-地中海贫血的起因是成人β-球蛋白基因座的异常，进而导致β样球蛋白链与α样链的异常化学计量，造成未配对的α样链沉淀。地中海贫血的严重程度直接与该球蛋白链的不平衡度相关。接下来通过数条通路介导的损伤(包括细胞蛋白和膜蛋白的氧化)的最终结果是无效的红细胞生成、凋亡和红细胞存活减少。已经描述了导致β-地中海贫血的超过200个突变。

镰状细胞病的起因是β-球蛋白基因内的单核苷酸置换，进而造成谷氨酸被缬氨酸在肽的第6位氨基酸处所置换，产生βS。与正常成人血红蛋白(HbA)相反，携带该突变的血红蛋白S(α2,βS2)被称为HbS。在低氧浓度的情况下，HbS发生别构变化，在别构位点处其可聚合。脱氧形式的血红蛋白在E和F螺旋之间的蛋白上呈现疏水补丁。在血红蛋白β-链的第6位处的疏水性缬氨酸形成疏水补丁，所述疏水补丁可与其它血红蛋白S分子的疏水补丁相结合，导致血红蛋白S分子聚集并形成纤维沉淀，继而引起红细胞变为镰刀状并导致数条通路变化，这通过血管堵塞和溶血导致组织损伤。

尽管β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD)分别是β-球蛋白基因座的定量病症和定性病症，但正常β样球蛋白基因的表达可改善这两种疾病。在地中海贫血中，任何对球蛋白链不平衡的改进都可为每个细胞提供选择优势，并产生临床效益。在镰状细胞病中，正常或某些突变的β样链的存在可通过比突变的镰状细胞链更有效地竞争α样链从而减少HbS的量，通过形成阻断Hbs(如HbF)的聚合的血红蛋白和增加每个细胞非镰变血红蛋白的量，来改善临床表型。例如，在镰状细胞病中，仅8％的胎儿血红蛋白(HbF)水平可抑制HbS聚合，这导致存活率提高，而20％的HbF水平提供近乎完全的表型校正。重要的是，含有正常HbA的供体红系细胞的后代在造血干细胞移植(HSCT)之后具有超过含HbS的内源来源的细胞的较强选择性优势。在骨髓中有11％供体细胞的患者具有35％的供体BFUe和73％的供体红细胞，这导致输血独立性。因此，修正相对小部分的移植HSC具有临床益处。