[发明专利]具有叶中改变的硝酸盐水平的转基因植物

说明书

技术领域

本发明涉及可以用于制备转基因植物的遗传构建体。构建体可以具有降低植物特别是植物的叶中硝酸盐浓度的能力。本发明扩展至用此类构建体转化的植物细胞和转基因植物本身。本发明还涉及产生转基因植物的方法和在植物中降低硝酸盐含量的方法。本发明还提供用于改变植物氨基酸概况的方法。本发明还涉及已用遗传构建体转化的收获的植物叶(例如烟草叶)和包含此类收获的植物叶的各种烟草制品(诸如吸烟制品)。

背景

氮同化对于植物生长具有根本重要性。在植物所需的所有矿物质营养物中，氮是最大丰度需要的。在田间植物摄取的氮的主要形式是硝酸盐和氨，其是氮肥的主要组分。根据可用性，植物从土壤中摄取硝酸盐或铵离子。硝酸盐在充分氧化的非酸性土壤中会更丰富，而铵会在酸性或积水土壤中占优势。对烟草生长参数的实验清楚地表明，相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积响应于渐增的硝酸盐供应而急剧增加。

植物已经发展了非常高效氮摄取系统以处理耕种土壤的硝酸盐含量的巨大变化。植物根通过特定硝酸盐转运蛋白(NTR)的作用摄取硝酸盐和氨。已经显示两个硝酸盐转运系统共存于植物中，NRT1基因家族和NRT2基因家族。据信，两个转运蛋白家族合作地作用以便从土壤摄取硝酸盐并将其分布在植物各处。通常假定NRT1基因家族介导根低亲和力转运系统(LATS，即当外部硝酸盐浓度>1 mM时)，而NRT2基因家族介导高亲和力转运系统(HATS，即当外部硝酸盐浓度<1 mM时)。在拟南芥中，已知七个基因属于NRT2基因家族。还已知，这些基因的表达受植物暴露的硝酸盐的浓度调节。然而，除了Atnrt2.1、Atnrt2.4和Atnrt2.7，其它NRT2基因的功能尚未阐明。

NRT2基因家族的最佳表征成员之一是Atnrt2.1。在拟南芥中，AtNRT2.1与NAR2 (AtNRT3)蛋白相互作用，以形成HATS的重要组分。拟南芥中AtNRT2.1硝酸盐转运蛋白的突变的、非功能性形式的过表达引起高亲和力硝酸盐摄取系统活性的显著降低和叶片硝酸盐含量的降低。作为结果，当拟南芥在低硝酸盐浓度中生长时，这些Nrt2.1突变体植物的生长受到严重损害。

Nrt2.7是表征不足的基因。已知其在植物种子，特别是在液泡膜中表达，并且其调节植物种子的硝酸盐含量。最近已经表征了硝酸盐转运蛋白Nrt2.4。NRT2.4蛋白参与在非常低的外部浓度下植物的根对硝酸盐的摄取和将硝酸盐装载到植物枝条的韧皮部。

硝酸盐转运蛋白、和硝酸盐和亚硝酸盐还原酶的活性调节在整个植物中控制主要氮同化中是关键的，且对于植物的生长和发育具有显著影响。然而，在某些条件下，硝酸盐可能积累，主要是在绿色光合活跃组织中积累，在那里它被储存在叶肉细胞的液泡中。当具有较低同化储存的硝酸盐的光合能力时，或作为土壤中高硝酸盐水平的结果，高水平的硝酸盐积累可以在低温和/或太阳辐射(例如，在冬季期间的温室作物中)期间发生。硝酸盐水平的增加可以具有许多有害后果，不仅在植物生长的方面，而且在消耗植物的人或动物健康以及环境后果的方面。硝酸盐积累的许多不利后果通过产生亚硝酸盐所介导。

因此，为了防止硝酸盐聚集，一个策略将是增加植物中的氮再动员(nitrogen remobilisation)，例如当它们变得衰老时，这可能在作物生产中具有重要应用。首先，从叶再动员的氮可以被转运至较嫩叶以及正在发育的种子。增强氮从衰老叶离开的效率因此可以潜在增加对植物的种子和较嫩部分的氮供给，从而增加作物产量和氮使用效率。当世界人口不断增加，但作物产量没有增加到足以满足需求时，这显然是有价值的目标。一种潜在的目标作物是欧洲油菜(Brassica napus)(油菜)，其由于从营养组织的差的氮再动员而具有差的氮效率。另一个目标作物是小麦，因为增强籽粒蛋白含量的潜在益处是巨大的。籽粒蛋白含量不仅影响小麦的营养价值，而且决定籽粒使用，并因此决定市场价值。例如，增加的籽粒蛋白含量导致增加的面包体积。

此外，增加氮再动员的能力在烟草行业中可以是非常有用的，因为已知烟草叶中的残余氮有助于亚硝胺类的形成，如图1所示。具体而言，硝酸盐和亚硝酸盐在烤叶(cured leaf)中充当烟草特异性亚硝胺(TSNA)形成的前体。烟草工业对烟草叶的处理涉及去除被认为充当硝酸盐储存器官的烤叶的叶柄和中脉，其缺乏味道且TSNA高。